[发明专利]奶中一种或多种蛋白的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及奶中一种或多种蛋白的提取方法。所述蛋白对所述奶中复合的或非复合的钙离子具有亲和性。

本发明中，复合的或非复合的钙离子指结合到酪蛋白以形成酪蛋白的胶束胶体结构的磷酸钙盐，或者指这些没有结合到酪蛋白并因此是自由的盐。这些离子也是溶解在奶中的与上述不同的各种钙盐和/或有机的和/或无机钙复合物。对奶中钙离子具有亲和性的蛋白是指那些自然存在的蛋白，例如乳清蛋白、乳球蛋白以及免疫球蛋白。这些蛋白也指存在于转基因动物奶中的重组蛋白，例如，血凝因子，尤其是因子Ⅶ、因子Ⅷ和因子Ⅸ。

背景技术

市售药物的主要部分对应于合成获得的化学物质。事实上，直到最近，现代医学高度依赖于利用化学合成生产的药物，用于疾病的诊断和治疗。

然而，蛋白代表携带生物信息的分子的实质部分，尤其是大量的激素、生长因子、血凝因子或抗体。

通常，蛋白质为基于氨基酸的聚合物，且大部分具有高分子量，其不能通过化学合成在可接受的成本下获得。这些用于治疗的蛋白质通常从人类或者动物组织或血液，例如活体，通过分离和纯化获得。尤其是从猪胰腺提取的胰岛素、从血浆中提取的例如为因子Ⅷ或因子Ⅸ的血凝因子、或者免疫球蛋白。

尽管目前上述蛋白质的制备方法被大量应用，然而，它们具有缺陷。从血小板中提取的一些蛋白，例如为促红细胞生成素，的低含量使得它们不能足够量的分离以满足不断增长的治疗需要。此外，在血浆蛋白的生产过程中，人体内病毒、朊病毒或者其他致病剂的存在需要添加病毒灭活和/或病毒消除的包涵体，以获得可用于治疗的有用产品。

为了克服这些缺陷，遗传工程被使用。该技术同样大量应用于合成蛋白中，从一个独立基因转移到负责分泌期望蛋白的细胞。从源细胞系统外获得的这样的蛋白称之为《重组》。

根据这一技术，可以使用不同细胞系统。

细菌系统，例如E.coli，大量应用且有效。它们能低成本的生产重组蛋白。然而，这些系统不能用于生产简单的非糖基化蛋白，其不需要精细折叠处理。

真菌系统同样应用于分泌蛋白的生产。这些真菌系统的缺陷在于它们是翻译后修饰的起因，包括，例如，接枝聚糖部分和硫酸基，其能高度影响生产的蛋白的药代动力学，尤其是添加甘露糖衍生物的不同基团。

使用杆状病毒的系统可以生产非常不同的蛋白，例如疫苗蛋白或生长激素，但是它们工业化应用不是最优的。

同样使用哺乳动物培养物以用于重组复合蛋白的生产，例如单克隆抗体。细胞表达系统导致正确的折叠的和修饰的重组蛋白。与生产成本相比，低的产量是其主要缺陷。

这些细胞系统的变体包括实现转基因植物以用于获得大量的蛋白。然而，这些系统产生植物-特异性翻译后修饰，尤其是在生产的蛋白中添加了高度致免疫木糖残基，因此限制了它们在治疗应用中的用途。

前面提到的细胞系统的替代包括使用转基因动物以用于生产重组疫苗或者复合治疗蛋白。因此，获得的蛋白表现出与人类接近的糖基化，且能被正确的折叠。这些复合蛋白并不仅由一个简单的例如为生长激素的多肽链组成，它们组装成氨基酸后用不同的途径被修饰，尤其是通过特异性断裂、糖基化和羧甲基化。大部分情况下，通过细菌细胞或酵母不能实现修饰。另一方面，转基因动物能同时结合细菌细胞系统中遇到的表达水平以及细胞培养物中获得的翻译后修饰，同时与使用细胞表达系统相比，降低了制造成本。

来自于转基因动物的生物材料中，奶是研究的目标，其被考虑为非常符合要求的分泌重组蛋白的来源。

从转基因动物的奶中生产的重组蛋白，能很容易的通过将编码所感兴趣蛋白的基因接枝到一个负责合成奶蛋白的基因的调控区而获得，其会指导特别是在乳腺中的合成，之后分泌到奶中。

例如，EP0527063描述了在转基因哺乳动物的奶中感兴趣蛋白的生产。提到了通过抗乳血清的启动子来控制编码感兴趣蛋白的基因的表达。

另外的专利申请或者专利描述了抗体（EP0741515）、胶原（WO96/03051）、人类因子Ⅸ（US6046380）、以及因子Ⅷ/血管性血友病因子复合物（EP0807170）在转基因哺乳动物的奶中的制备。

尽管这些方法在蛋白表达方面有满意的结果，但是使用奶作为重组蛋白的源具有缺陷。主要缺陷一方面在于难以从奶中提取获得满意的产量，另一方面在于接下来难以提纯。