[发明专利]基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法有效
| 申请号： | 201410138517.7 | 申请日： | 2014-04-08 |
| 公开（公告）号： | CN103911449A | 公开（公告）日： | 2014-07-09 |
| 发明（设计）人： | 赵小东;邵志峰;康亚妮;赖登攀;吴俊 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 上海旭诚知识产权代理有限公司 31220 | 代理人： | 郑立 |
| 地址： | 200240 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 seq 基因组 范围 分析 apa 方法 | ||
1.一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，包括：（1）含有oligo dT引物的磁珠的制备；（2）用所述磁珠与总RNA混合，筛选含有Poly A的RNA；（3）逆转录，双链cDNA第二链合成，双链cDNA断裂；（4）在DNA水平移除Poly A结构；（5）末端修饰后连接测序接头；（6）文库回收及扩增。
2.根据权利要求1所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述oligo dT引物5'端含有Gsu I酶切位点，用以后续移除Poly A结构。
3.根据权利要求2所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述oligo dT引物的5'端含有Gsu I的酶切位点的保护序列。
4.根据权利要求1所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述oligo dT引物的5'端用生物素修饰，用以与带链霉亲和素的磁珠连接。
5.根据权利要求1所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述oligo dT引物序列为5'-GAGCTAGTTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'。
6.根据权利要求2所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述逆转录使用未甲基化的dATP、dGTP、dTTP和甲基化的dCTP，以封闭基因序列中的Gsu I酶切位点。
7.根据权利要求2所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，在所述双链cDNA第二链合成中，使用未甲基化的dCTP、dATP、dGTP和dUTP，通过RNase H、E.coli DNA聚合酶、E.coli DNA连接酶的作用进行合成。
8.根据权利要求1所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述双链cDNA的断裂，使用双链DNA断裂酶处理、DNase I处理或超声断裂。
9.根据权利要求2所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述移除Poly A结构为：利用Gsu I酶进行酶切，释放连接在所述磁珠上的目的片段。
10.根据权利要求1所述的一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，适用于起始总RNA量为10ug-100ug。
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