[发明专利]基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测RNA PAS（Poly A Site）的方法，尤其涉及一种基于3T-seq（TT-mRNA Terminal Sequencing）技术在全基因组范围内分析APA(Alternative Polyadenylation)的方法。

背景技术

在人类基因组中，有一半以上的基因存在多个聚腺苷酸化位点(PAS，Poly A Site)。在前体mRNA成熟过程中，通过改变前体mRNA的切割位点和聚腺苷酸化位点（PAS）而从一个编码区产生带有不同长度的3’非编码区(3’UTR)的成熟mRNA，这种情况称为选择性聚腺苷酸化(APA，Alternative Polyadenylation)。APA在调控细胞增殖、分化、转运和发育以及疾病发生如肿瘤发生发展等生理和病理过程都发挥了至关重要的作用。

在全基因组范围内研究APA变化的现有技术有多种，但原理都相近。其中两种最具有代表性方法为SAPAS（Sequencing APA Sites）和3P-Seq（Poly(A)Position Profiling by sequencing）。文献记载的SAPAS方法（Fu Y,Sun Y,Li Y,Li J,Rao X,Chen C,Xu A.Differential genome-wide profiling of tandem3'UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.Genome Res.2011,21(5):741-747.），其实验原理如下：将RNA直接加热断裂后，用含有oligo dT的引物逆转录出第一链cDNA，链置换的方法合成双链cDNA。然后用突变的oligo dT（TTTTCTTTTTTCTTTTTT）与测序接头连接作为PCR引物扩增，扩增出的产物中则不含有poly A结构，以此避免poly A结构对测序质量的影响。文献中记载的3P-Seq方法（Jan CH,Friedman RC,Ruby JG,Bartel DP.Formation,regulation and evolution of Caenorhabditis elegans3'UTRs.Nature,2011,469(7328):97-101.），其实验原理图如下：用oligo dT将含有poly A序列的RNA筛选出后，3'端加上一个带Biotin修饰的RNA接头，然后经过RNase T1断裂RNA后用含有链霉亲和素的磁珠筛选含有poly A的片段，再用只含有dTTP的逆转录体系将poly A结构逆转录成杂合双链，利用RNase H的特性水解poly A结构，将含有APA位点的片段从磁珠上释放下来，两端加上RNA接头后合成双链cDNA，进行PCR扩增后即为可用于测序的文库。

现有技术中SAPAS法不能彻底消除polyA未切除对测序的影响，3P-Seq法中RNA水平操作繁杂，经过多步的RNA连接和酶切，对RNA的损伤和损失也较大，不适用于少量样品文库的构建。且此方法难度较大、成本较高。另外，操作过程中断裂方式存在局限性，即3P-Seq法中RNase T1酶切断裂和SAPAS法中RNA直接加热断裂的方法不能做到既能不损伤RNA同时又能随机断裂。

发明内容

有鉴于现有技术不能彻底消除Poly结构对测序的影响、因操作繁杂引起的RNA损伤和损失、断裂方式的局限的缺陷，本发明旨在提供一种基于3T-seq（TT-mRNA Terminal Sequencing）全基因组范围分析APA的方法，以尽可能减少RNA水平操作，在DNA水平移除Poly A序列，消除Poly结构对测序的影响；尽可能简化实验流程，降低步骤繁琐引起的损失，同时降低实验难度和造价，使其应用范围更广；选择合适的断裂方法，尽量做到在不影响文库质量的基础上在DNA水平断裂。

本发明采用以下技术方案解决上述问题：

提供一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，包括：（1）含有oligo dT的磁珠制备；（2）用所述磁珠与总RNA混合，筛选含有Poly A的RNA；（3）逆转录，双链cDNA第二链合成，双链cDNA断裂；（4）在DNA水平移除Poly A结构；（5）末端修饰后连接测序接头；（6）文库回收及扩增。

进一步地，oligo dT引物5'端含有Gsu I酶切位点，用以后续移除Poly A结构。Gsu I酶可以移除识别位点下游14-16个碱基，使文库分子留下AA的粘性末端。