[发明专利]一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用

权利要求书

1.一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法，包括以下步骤：

1）获得重组基因：获得表达人脑利钠肽重组蛋白的重组基因rhBNP，所述重组基因rhBNP的序列包括5’至3’方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列；

2）获得重组质粒：将上一步获得的重组基因rhBNP插入质粒，获得含有重组基因rhBNP的重组质粒；

3）获得基因工程菌：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞获得基因工程菌；

4）表达外源基因：基因工程菌发酵表达含有重组人脑利钠肽的融合蛋白；

5）纯化目的蛋白：裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组人脑利钠肽重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述分子伴侣蛋白选自大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）、大肠杆菌二硫键形成蛋白A突变体（DsbA^mut）、CMP-KDO合成酶（CKS）、硫氧还蛋白（Trx）或麦芽糖结合蛋白（MBP）。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述纯化标签蛋白选自6×His（His-Tag）、谷胱甘肽S转移酶（GST）或FLAG?。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白酶选自凝血酶或肠激酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于人脑利钠肽基因序列为经过密码子优化的基因序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于重组基因rhBNP两端可包含限制性酶切位点或用于与质粒进行同源重组的序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述质粒为含有T7强启动子的原核表达质粒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述质粒为含有卡那霉素抗性的原核表达质粒。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述融合蛋白的酶切、纯化步骤采用五步纯化法，该五步纯化法依次为亲和层析、酶切融合蛋白、离子交换层析、反相层析和离子交换层析。