[发明专利]一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用。本发明还涉及一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的重组基因。 

背景技术

随着人口老龄化进程的加快与高血压、冠心病等常见心血管病发病率的上升，心衰的患病率正逐年升高。根据美国的统计资料显示，美国目前有490万心衰患者，并且每年有40-70万新增患者，人群中心衰的患病率约为1.5%-2.0%，65岁以上人群可达6%-10%。在过去8年中，由于心衰导致的死亡人数增加了6倍。在2000-2001年亚洲心血管病国际合作研究中，中国心血管健康多中心合作研究组研究结果显示，我国成年人心衰的患病率为0.9%，其中35-74岁成年人中约有400万心衰患者。 

目前充血性心衰治疗主要包括：静脉注射强心药（洋地黄类药、拟肾上腺素类药、磷酸二酯酶抑制剂等）和扩血管药（硝化甘油、硝普钠等）。但产生的副作用表现在：药物耐受性、心动过速及其它心律失常、低血压、以及激活与心力衰竭病理过程有关的神经激素-血管紧张素系统。近年来研究发现，人脑利钠肽作为人体分泌的内源性多肽，可降低心脏前、后负荷，改善慢性心脏病人急性发作时的症状，具有强心和扩张血管作用。对于改善充血性心力衰竭（CHF）病人的血液动力学，如动脉和静脉扩张、增加钠排泄以及抑制肾素-血管紧张素-醛固酮和交感神经系统有较好的作用，同时人脑利钠肽不强制性地增强心肌的收缩能力，且没有目前扩血管药和利尿药物对血压和心率改变的副作用；作为药物不论从其对不良反应的控制或者疗效等方面考虑均明显优于传统药物。 

人脑利钠肽（Human Brain Natriuretic Peptide, hBNP）又称B型利钠肽（B-type Natriuretic Peptide），最初是由日本学者Sudoh在1988年从猪脑分离出来因而得名，实际上它主要来源于心室。BNP是心力衰竭时人体分泌的作为代偿功能的一种内源性多肽，是继心钠肽（Atrial Natriuretic Peptide，ANP）后利钠肽家族的又一成员，利钠肽家族主要包括心钠肽、脑利钠肽、C型利钠肽(C-type Natriuretic Peptide，CNP)，D型利钠肽（D-type Natriuretic Peptide，DNP)以及尿钠肽 (Urodilati）。在心脏中，BNP主要存在于左右心房，其中右心房含量最高，但60%的分泌来自心室。生理状态下，心房、心室合成和分泌少量的BNP，因此正常人循环血液中仅有低浓度的BNP，在病理状态下，如心室壁张力增加时，BNP由心肌组织大量合成与释放。正是由于脑利钠肽的这种病理状态下的变化，可以通过对人体中的BNP浓度来诊断心力衰竭及判断预后。有研究表明，BNP对心力衰竭的诊断价值远远超过临床专家的诊断。目前，BNP已经成为诊断心力衰竭的一项生化指标。 

人脑利钠肽与特异性的利钠肽受体（该受体与鸟苷酸环化酶相藕联）结合，引起细胞内环单磷酸鸟苷（cGMP）的浓度升高和平滑肌细胞的舒张。作为第二信使，cGMP能扩张动脉和静脉，迅速降低全身动脉压、右房压和肺毛细管楔压，从而降低心脏的前、后负荷，并迅速减轻心衰患者的呼吸困难程度和全身症状。 

脑利钠肽是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的天然拮抗剂，它可以拮抗心肌细胞、心纤维原细胞和血管平滑肌细胞内的内皮素、去甲肾上腺素和醛固酮。它可以提高肾小球滤过率，增强钠的排泄，减少肾素和醛固酮的分泌，亦抵制后叶加压素及交感神经的保钠保水、升高血压作用。脑利钠肽参与血压、血容量以及水盐平衡的调节，增加血管通透性，降低体循环血管阻力及血浆容量，从而降低了心脏前、后负荷，并增加心输出量。同时脑利钠肽没有正性肌力作用，不增加心肌的耗氧。 

脑利钠肽的制备主要有化学合成法和基因工程法，其中化学合成脑利钠肽成本高，价格昂贵，产业化困难。现阶段普遍采用的重组BNP制备方法主要采用自身串联融合表达和与其他载体蛋白融合表达两种，大都在胞内积累，易形成包涵体，而从包涵体复性具有生物活性的蛋白，需要经过一系列的变性复性的过程，工艺复杂且收率较低。同时，也有采用添加曲拉通X-100的化学渗透发酵方法，提高蛋白质在发酵过程释放至胞外。但是加入曲拉通会对会使菌体破裂，曲拉通加入量和提高蛋白收率的矛盾无法解决。为了解决上述问题，本发明用基因重组技术，实现BNP在大肠杆菌中的可溶性高效表达，制备高纯度、高活性的人脑利钠肽。