[发明专利]一种重组羊痘病毒转移载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组羊痘病毒转移载体，其特征在于：所述重组羊痘病毒转移载体是在含有抗性基因和质粒复制子序列，并能用HindⅢ和AvrⅡ酶切的载体，如pVAX1载体，通过引入HindⅢ和AvrⅡ酶切位点插入DNA片段；所述DNA片段包含带有双向痘病毒启动子和羊痘病毒TK基因的同源臂的基因序列。

2.根据权利要求1所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于：所述痘病毒启动子为p11和p7.5。

3.根据权利要求2所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于：所述重组羊痘病毒转移载体的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1。

4.根据权利要求1所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于：所述羊痘病毒TK基因的同源臂长度为1400bp-1600bp，优选1500bp。

5.根据权利要求1所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于：所述DNA片段中还包括报告基因和压力筛选基因；作为优选，所述报告基因为绿色荧光蛋白GFP，所述压力筛选基因选用表达鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶的基因gpt。

6.根据权利要求5所述的重组羊痘病毒转移载体，其特征在于：所述重组羊痘病毒转移载体的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2。

7.一种重组羊痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于：步骤如下：

（1）以pVAX1载体为模板，利用PCR方法扩增含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因的DNA目的片段，得到目的片段Kan^r-ori；

（2）将双向痘病毒启动子、羊痘病毒TK基因的同源臂和多克隆位点进行DNA合成，得到如图2所示的载体片段，两端分别加入内切酶AvrⅡ和HindⅢ序列，并连接于载体上；

（3）将步骤（1）得到的目的片段和步骤（2）得到的重组质粒分别双酶切，酶切产物连接环化，得到重组载体ptkpp；

（4）提取羊痘病毒弱毒株AV41基因组DNA，利用PCR方法扩增含有TK基因的同源臂序列（约1500bp），替换质粒ptkpp中的TK基因同源臂，得到重组载体pftkpp；

（5）将报告基因和压力筛选基因插入到质粒pftkpp的多克隆位点，置于p11启动子后，构建成重组质粒pftkpgigp。

8.含有权利要求1-6任一所述的重组羊痘病毒转移载体的重组羊痘病毒。

9.根据权利要求8所述的重组羊痘病毒，其特征在于：所述重组羊痘病毒是将权利要求1-6任一所述的重组羊痘病毒转移载体导入羊痘病毒感染的细胞中，两者的同源序列在细胞内同源重组后得到的。

10.权利要求1-6任一所述的重组羊痘病毒转移载体、权利要求8或9所述的重组羊痘病毒在外源抗原转运中的应用。