[发明专利]一种重组羊痘病毒转移载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组羊痘病毒转移载体及其构建方法和应用。

背景技术

利用病毒作为外源抗原的转运系统是一种成熟、有效的疫苗设计研发策略，如腺病毒活载体、痘病毒活载体、疱疹病毒活载体、小RNA病毒活载体等作为新型疫苗均取得了良好的免疫效果。其中，痘病毒由于其大而复杂的基因组，作为活载体具有容量大、有大量的复制非必需片段可用作插入外源基因的位点等优势，因此成为此类疫苗研究的理想载体。目前已构建的痘病毒载体，有痘苗病毒、鸡痘病毒、猪痘病毒、羊痘病毒以及兔痘病毒活载体。

痘病毒基因组庞大，不便在体外进行直接操作，而且基因组DNA没有感染性，外源基因不能直接插入到病毒基因组中，因此，重组痘病毒的构建必须分两步进行。第一步是构建一个重组质粒，又叫转移载体质粒。此质粒应带痘病毒的启动子，其下游接外源基因，在它们的两侧为痘病毒特异的DNA序列。第二步是将此质粒导入痘病毒感染的细胞中，痘病毒DNA与质粒中的同源序列在细胞内可发生同源重组，由此将外源基因组装到痘病毒基因组的特定部位，构建出重组的痘病毒。

由于重组效率相对较低（10-4-10-3），筛选、纯化重组成功的痘病毒成为痘病毒活载体研究中的另一个重要环节。在较早的研究中，利用病毒本身的胸苷激酶(TK)基因作为选择标记，是较常用的方法。但此筛选系统具有很大的局限，即只能用TK基因作为非必需片段构建重组病毒；另外，需要一株适合病毒生长并能产生蚀斑的TK-细胞系。另一类筛选系统利用细菌β-半乳糖苷酶(LacZ)基因，新霉素磷酸转移酶(Neo)基因等作为标记基因，在构建转移载体时插入到复制非必需区。最近的筛选系统进行了优化，利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作为标记基因，同时加入了大肠杆菌鸟嘌呤- 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（guanine-hypoxanthine phosphoribosyl transferase，gpt）的基因作为压力筛选基因，筛选效果显著提高。

经过众多学者的不断探索，重组痘病毒作为活载体的研究日趋完善，羊痘病毒作为其中一员也成为此类活载体的重要工具。如前所述，在重组羊痘病毒时，同样需要构建一个携带同源臂的转移载体。在以往的研究中，载体构建主要是利用羊痘病毒基因组DNA复制非必需区中自然存在的酶切位点，插入外源DNA，如TK基因中的KpnⅠ。这类操作有一定的局限性，在需要替换外源DNA时，必须重新构建并鉴定用于重组的载体，增加了很大的工作量。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种重组羊痘病毒转移载体，该重组载体可方便插入外源基因。并根据重组结果进行了改良，最后达到了较好的重组效率，为此类重组疫苗的研制奠定了良好的基础。

本发明提供一种重组羊痘病毒转移载体，所述重组羊痘病毒转移载体是在含有抗性基因和质粒复制子序列，并能用HindⅢ和AvrⅡ酶切的载体，如pVAX1载体，通过引入HindⅢ和AvrⅡ酶切位点插入DNA片段；所述DNA片段包含带有双向痘病毒启动子和羊痘病毒TK基因的同源臂基因序列。

本发明的重组载体是利用含有抗性基因和质粒复制子序列，并能用HindⅢ和AvrⅡ酶切的载体构建的，只要含有上述基因和酶切位点，均能构建方便插入外源基因的重组载体。如，我们可以选择商业载体pVAX1载体，其含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因（Kanamycin resistance gene），并具有HindⅢ和AvrⅡ的酶切位点。

作为优选，所述痘病毒启动子为p11和p7.5。

更优选地，所述重组羊痘病毒转移载体的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1。

作为优选，所述羊痘病毒TK基因的同源臂长度为1400-1600bp，优选1500bp。

在该范围内重组效率均较高。

作为优选，所述DNA片段中还包括报告基因和压力筛选基因；作为优选，所述报告基因为绿色荧光蛋白GFP，所述压力筛选基因选用表达鸟嘌呤-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶的基因gpt。

作为优选，所述重组羊痘病毒转移载体的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2。

本发明还提供一种重组羊痘病毒转移载体的构建方法，步骤如下：

1)以pVAX1载体为模板，利用PCR方法扩增含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因的DNA目的片段，得到目的片段Kan^r-ori；