[发明专利]一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法

权利要求书

1.一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，包括以下步骤： 

1）提取待测样品总RNA作为反应模板； 

2）以步骤1所提取的RNA为模板，利用T3基因型的特异性引物T3-4R进行反转录反应，得到反转录产物cDNA； 

3）利用特异性引物T3-4F和T3-4R，以及步骤2得到的反转录产物cDNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR检测； 

所述的特异性引物T3-4F和T3-4R序列如下： 

T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT 

T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA。 

2.根据权利要求1所述的一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，其特征在于： 

所述步骤2的反转录反应，反应体系为：总反应体系10μL，其中RNA反应模板4μL，5×RT-buffer 2μL，浓度为10mM/L的dNTPs 0.5μL，浓度为10μmol/L的引物T3-4R 0.5μL，浓度为30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL，浓度为100U/μL的反转录酶RTase 0.5μL，无RNase超纯水2μL；反应程序为：42℃反转录30分钟，94℃加热1分钟。 

3.根据权利要求1所述的一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，其特征在于： 

所述步骤3的实时荧光定量PCR反应，反应体系为：总反应体系20μL，其 中2×SYBR Green Supermix10μL，浓度为10μmol/L的引物T3-4F和T3-4R各0.2μL，无RNase超纯水8.6μL，步骤2得到的反转录产物cDNA模板1μL；PCR扩增程序为：95℃预变性30秒，95℃变性5秒，63℃退火15秒，72℃延伸20秒，40个循环。 

4.根据权利要求1所述的一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，其特征在于： 

所述步骤3的实时荧光定量PCR反应检测，以柑橘Fbox基因为内参照基因，采用2^-ΔΔCt方法对CTV T3基因进行相对定量分析。