[发明专利]一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种柑橘衰退病毒的检测方法，尤其是一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，属于生物技术领域。

背景技术

目前生物学中定量检测的方法有转磷光免疫层析技术、实时荧光定量PCR技术等，其中实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQPCR)技术在目前定量检测技术中使用最广泛，精确度最高。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

Taqman实时荧光定量PCR技术是1996年美国PE公司发明的一种高灵敏度PCR试验方法。其技术原理是在PCR的反应体系中加入一条带有双荧光标记的探针，该探针能与模板核酸发生特异性杂交。探针的5’端标记荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素，荧光发射值在518nm处)，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明，荧光发射值在582nm处)。探针结构完整时，5’端FAM所发出的荧光被3’端TAMRA所吸收，不出现荧光信号的变化。随着PCR反应的进行，当合成的新链移动到探针结合的位置时，Taq聚合酶将探针切断，探针的完整性遭到破坏，3’端的淬灭作用被解除，5’端的FAM荧光信号被释放出来。PCR每复制一个核苷酸片段，就有一个探针被切断，同时一个荧光信号被释放出来，产物与荧光信号产生一对一的对应关系。随着产物的增加，荧光信号亦随之增强，当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，计算出99.7％的置信度大于平均值的荧光值，即为阈值)，此时的循环次数即循环阈值Ct(cycle threshold，Ct)被记录下来。该循环参数Ct和PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系。利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟合制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以准确的确定起始模板的数量，因此根据PCR产物的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。

此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。

由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）引起的柑橘衰退病是柑橘生产中的重要病害之一，对全世界的柑橘产业造成了严重的损失。CTV是目前已知植物病毒中基因组最大的病毒，其病毒颗粒呈纤维状弯曲，大小为11nm×2000nm。其基因组为包含12个开放阅读框（ORFs）和5’端及3’端非翻译区（UTRs）的一条正义单链RNA。CTV主要通过带毒繁殖材料嫁接和蚜虫传播，其中褐色橘蚜是最有效的传播媒介。已有研究表明CTV存在不同的变异株系，导致柑橘不同程度的损失。目前已有报道的能引发柑橘表现症状的CTV有4种不同基因型（T36、T30、T3、VT）：T36基因型CTV分离株主要引起速衰症状，T3、VT基因型CTV分离株主要引起茎陷点症状。目前已有许多技术检测和区别不同基因型CTV分离株，应用TaqMan探针法能够对T36、T30、VT三种基因型CTV分离株进行定量分析，但利用荧光定量RT-PCR特异、高效检测T3基因型CTV分离株的技术体系尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，用于柑橘衰退病毒T3基因型的特异、灵敏、快速、高效检测。

本发明所采用的技术方案如下：一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，包括如下步骤：