[发明专利]重组猪细小病毒VP2蛋白、表达该蛋白的重组多角体病毒及其在疫苗制备和病毒诊断中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组猪细小病毒VP2蛋白、表达该蛋白的重组多角体病毒及其在疫苗制备和病毒诊断中的应用，特别涉及一株自行制备得到的表达VP2蛋白的重组多角体病毒AcMNPV（pFastBac-VP2），该病毒能够实现在细胞中对VP2蛋白的高效表达，本发明还涉及重组猪细小病毒VP2蛋白在制备猪细小病毒VP2亚单位疫苗以及在制备诊断或检测猪细小病毒感染的试剂中的应用。本发明属于生物疫苗和猪细小病毒的检测与诊断领域。 

背景技术

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一，PPV感染的主要对象是孕猪，特别是怀孕前的初产母猪，能够引起怀孕母猪流产、产死胎、胎儿木乃伊化等，而母体通常缺乏临诊症状，此外也会引起其他症状。自1966年Mayr和Mahnel发现和证实PPV存在及其致病性以来，国内外学者对其进行了广泛深入的研究。近年来，PPV感染呈扩大上升趋势，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。在我国，潘雪珠于1983年首次分离到了PPV。此后，在各地陆续分离到了数株PPV，目前，人们发现猪细小病毒经常与其他一些病毒，例如猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等混合感染，导致断奶仔猪多系统综合征、皮炎、呼吸道综合征等，给世界的养猪业造成很大的损失。虽然不同分离株均属于同一血清型，但可以引起多种临床症状，但都以造成繁殖障碍为主。目前，我国经产母猪及种公猪PPV阳性率高达80%以上。 

由于PPV在细胞中增殖困难，效价不高，而其主要免疫原为VP2蛋白，因此本发明的发明人在2005年从黑龙江省某猪场分离到一株猪细小病毒，经实验室鉴定为强毒株，驯化克隆后将该毒株命名为PPV BQ-C株。该病毒株已记载在申请号为“201210166453.2”，发明名称为“猪细小病毒BQ-C株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用”的专利申请中。将PPV BQ-C株的VP2基因，克隆到重组多角 体病毒表达载体中，制备获得了高效价的表达VP2的重组多角体病毒，并开展了猪细小病毒病VP2亚单位灭活疫苗的研制开发工作，筛选培育出免疫原性良好、效价稳定的表达VP2的重组多角体病毒AcMNPV（pFastBac-VP2），命名为重组多角体病毒AcMNPV（pFastBac-VP2株），并且选择了最适合制备疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等都进行了试验测定，并获得了大量的试验数据，结果证明本疫苗安全有效。在此基础上，进行了中试生产，经抽样检验，全部符合拟定的质量标准，并对中试产品进行了安全试验和效力试验，其结果也证实本疫苗能有效地预防由猪细小病毒引起的母猪繁殖障碍，在实验室试验、中间试验的基础上，本发明研制出了猪细小病毒（BQ-C株）VP2亚单位灭活疫苗，其结果也证实本疫苗能有效地预防由猪细小病毒引起的母猪繁殖障碍性，进一步验证了本疫苗的各项质量标准。同时，利用表达的VP2蛋白，制备了疫苗对应的ELISA检测方法。该方法敏感性好、特异性高，阴阳性临界值为：0.181+3×0.030=0.271，最后确定判定范围0.25-0.3为可疑。当OD450nm＞0.3判为阳性；OD450nm＜0.25为阴性。与法国LSI试剂盒的比较符合率为96.7%。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种改造后的重组猪细小病毒VP2蛋白，该蛋白具有效价高，免疫原性好等优点； 

本发明的目的之二是提供一种稳定表达上述重组猪细小病毒VP2蛋白的重组多角体病毒AcMNPV； 

本发明的目的之三是提供所述改造后的重组猪细小病毒VP2蛋白在制备预防猪细小病药物以及在制备检测或诊断猪细小病毒抗体试剂，特别是ELISA检测试剂中的应用。 

本发明的目的之四是提供所述稳定表达重组猪细小病毒VP2蛋白的重组多角体病毒AcMNPV在制备预防猪细小病药物中的应用。 

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段： 

本发明的发明人在利用已有发明的专利毒株PPV BQ-C株基因组为模板的基础上，对vp2基因序列用软件进行分析后发现，vp2基因序列在sf9细胞中表达效率较低，分析原因可能是这个序列来源于病毒，由于种属差异而无法在昆虫细胞中很好表