[发明专利]一种检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及一种检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的方法，以牛的肉用性状基因的单核苷酸多态性（SNP）作为分子遗传标记，特别涉及牛的A-FABP（脂肪型脂肪酸结合蛋白）基因的单核苷酸多态性位点及其应用。

背景技术

随着经济的发展，人们对于牛肉的数量和品质要求日益提高。虽然我国已成为第三大养牛与牛肉生产国，但是高档大部分依赖于进口。因此提高肉用性能势在必行，途径主要有改善饲料营养，加强饲养管理水平和培育优良品种等，而良种是肉牛业发展的先决条件和物质基础。人们在了解肉用性状的遗传规律和相应的生长发育、脂肪沉积等生命活动调控规律的基础上，结合分子生物学方面的研究，发现了与肉用性状有密切联系的功能基因和主效基因以及和这些基因连锁的分子遗传标记，根据目标性状与候选基因基因型间的关联性进行选择，提高了育种方向的准确性，缩短了育种年限。

 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP)，指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

  分子生物学的发展为分子标记辅助选择提供了理论基础和技术支持，通过检测功能基因某位点的多态性，对不同基因型个体与其生产性能进行关联分析，找出优势基因型和优势等位基因，为选种提供依据，这一过程中检测多态性和基因分型的准确是很关键的。目前主要的方法有PCR-RFLP技术或PCR-SSCP技术结合DNA测序。

  A-FABP基因编码脂肪型脂肪酸结合蛋白，在脂肪细胞中高度表达，牛A-FABP基因能通过调控激素敏感酯酶HSL的功能，在脂质水解和细胞内脂肪酸转运中发挥关键作用。同时，脂肪型脂肪酸结合蛋白可在细胞内与脂肪酸结合，造成细胞内外脂肪酸浓度差，从而促进细胞摄取脂肪酸，并能在脂肪细胞中沉积甘油三酯，提高肌内脂肪含量。而随着肌内脂肪含量的增加，肉的嫩度、风味、多汁性等都得到了改善，大理石纹评分更加理想，提高了牛肉的品质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛A-FABP基因SNP的筛查和检测方法，本发明解决的问题在于利用PCR产物混合测序的方法筛查牛A-FABP基因的多态性位点。通过关联分析寻找与牛肉质性状相关的SNP作为分子标记，以功能SNP作为牛分子育种和辅助选择的标记，加快良种选育速度和提高种群品质。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明根据A-FABP基因的外显子设计引物，分别以8种牛品种的基因组DNA为模版，进行PCR扩增，对PCR产物混合并纯化，测序后得到牛A-FABP的部分序列。

一种用于检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的引物，所述的引物对P1为：正向引物F:5'-AGGCGTGGGCTTTGCTAC-3'；反向引物R:5'-GAATGGCTTTCCTCCTTCTACA-3'。

一种检测肉牛A-FABP基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

⑴ 以包含A-FABP基因的待测牛基因组DNA为模版，以引物对P1为引物，PCR扩增牛A-FABP基因；

⑵ 对步骤⑴的扩增产物进行PCR目的片段检测；

⑶ 对步骤⑵的目的片段进行PCR-SSCP检测：首先对目的片段分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性位点。

所述多态性位点包括：在牛的A-FABP基因第2989位为A或G的碱基多态性位点，表现为AA、AG、GG三种基因型。

所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火40s；72℃延伸30s；72℃延伸7min；4℃保存。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。