[发明专利]一种以载体两性电解质修饰γ-谷氨酰转肽酶固定化酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种修饰固定化酶的方法。

背景技术

近年来，介孔氧化钛（MTiO₂）作为一种备受关注的新型高性能材料，在光催化、吸附、分离等领域的应用研究十分活跃。同时，由于其具有比表面积高、结构高度有序、中空孔径连续可调、生物相容性高、机械强度高、水热稳定性高等优势，可作为有机或生物分子的载体，在药物缓控释和固定化酶领域具有广阔的应用前景。

γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC2.3.2.2））是生物体内谷氨酰循环中的关键酶，随着对GGT反应认识的不断深入，人们逐渐认识到其在生物合成领域的潜在价值。研究表明，GGT是一种异源二聚体蛋白，由大、小2个亚基组成，催化残基是-Thr，位于小亚基上。根据GGT的反应机制，GGT的首先亲核攻击供体（如谷胱甘肽）的γ-羰基碳原子，形成酶-底物复合物；随后在受体亲核基团（如-NH2）的攻击下，酶-底物复合物分解，将谷氨酰基转移给受体分子，形成新的谷氨酰化合物。由于反应体系中存在的水分子也具有极强的亲核性，因此GGT反应中也存在水解副反应，产物为谷氨酸（见图1）。

为了有效抑制水解副反应，体外的谷氨酰基化反应需要在碱性pH值（pH>8.5）下进行，此时供体分子的亲核性更强，可竞争性地抑制水解副反应。但由于GGT在碱性条件下的稳定性较差，极易发生亚基解聚，制约了GGT反应在工业生物合成领域的应用。因此，如何有效提高GGT的pH耐受性对于进一步拓展GGT反应的工业化应用具有重要意义。目前，提高酶制剂pH耐受性的方法主要通过定点突变或分子进化等分子生物学手段，不仅周期长、成本高，且结果具有高度的不确定性，成功率不高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以载体两性电解质修饰γ-谷氨酰转肽酶固定化酶的方法，以提高酶制剂的pH耐受性。

为解决上述技术问题，本发明采用的思路如下：以高比表面积的介孔氧化钛（MTiO₂）为载体，采用硅烷化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对MTiO₂材料表面进行化学改性，并以改性后载体MTA对GGT进行固定化，最后，采用载体两性电解质Pharmalyte（CA，pH8.0～10.5）对固定化酶进行后修饰，在提高载体担载量及固定化酶稳定性的同时，有效提高了γ-谷氨酰转肽酶固定化酶的pH耐受性，使其在广泛的溶液pH环境下均具有稳定的催化活性。

具体的技术方案如下：

一种以载体两性电解质修饰γ-谷氨酰转肽酶固定化酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）甲苯的溶剂环境中，用硅烷化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对介孔

氧化钛（MTiO₂）表面进行化学改性反应，得到改性后的介孔二氧化钛（MTA）；

（2）将γ-谷氨酰转肽酶（GGT）酶液和步骤（1）得到的介孔二氧化钛混合，振荡制得固定化酶（MTA-GGT）；

（3）将步骤（2）得到的固定化酶（MTA-GGT）与两性电解质Pharmalyte（CA）（pH8～10.5）混合，振荡反应；

（4）将步骤（3）反应液滤去残液，用缓冲液洗涤，滤干后即得。

步骤（1）中，所述的介孔氧化钛的比表面积为96.539m²/g，所述的介孔氧化钛预先在真空干燥、100℃～150℃条件下处理8～20h；优选在100～120℃条件下处理10～20h；最优选在120℃下处理12h。

步骤（1）中，对于1g介孔二氧化钛，3-氨丙基三乙氧基硅烷的加入量为1～5ml，优选1～3ml，最优选2.47ml；甲苯的加入量为80～120ml，优选80～100ml，最优选100ml。

步骤（1）中，化学改性反应温度为50～120℃，优选50～100℃，最优选70℃；反应时间3～10h，优选5～10h，最优选8h。