[发明专利]一种检测猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒的二重PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多重PCR检测方法，特别涉及一种检测猪组织中猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒的二重PCR方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科的传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的猪的一种接触性传染病，呈世界性分布，从20世纪60年代末期，我国就有关于该病的报道，近年来疫区更为扩大，给养猪业造成巨大经济损失。其临床以呕吐、严重腹泻和脱水性肠炎为主要特征。不同年龄和品种的猪均易感，尤其对2周龄以内的仔猪，其致死率高达100%。TGE病毒属于冠状病毒科冠状病毒属。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的急性、高度接触性肠道传染病，我国从1976年开始就陆续有PED的报道，近几年来PED的流行日趋严重，自2010年下半年以来，中国华南、华东和华北部分省份出现了严重的仔猪腹泻流行，造成大量哺乳仔猪的死亡，也给养猪业造成了巨大的经济损失。其临床以水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征，病理变化主要表现在猪的空肠和回肠部分的肠绒毛萎缩和脱落。

以上二种病均是是猪场常见的病毒性腹泻，病毒性腹泻造成了猪场饲料报酬降低、药物和人力增加等重大损失，是危害猪场最严重的疾病之一。由于TGE、PED有相似的临床表现及传染途径，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，如病毒分离、免疫荧光试验、PCR技术等。传统的诊断技术如病毒分离、免疫荧光试验等费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查。而PCR技术具有特异性强，敏感度高，可进行活体诊断等特点，在实验室诊断中具有较突出的优势。

多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，采用多对特异性引物对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。其通过在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物进行PCR扩增，可同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。

由于多重PCR同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节省珍贵的实验样品，所以一经提出，即得到众多研究者的青睐，并且发展迅速，在生命科学的各个领域，多重PCR已经成为一项成熟而重要的研究手段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种直接从样品中一次检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的多重PCR检测方法，其较现有报道的PCR检测方法提高了检测效率。

针对实际生产中二种病毒往往是混合感染，很难区分的情况，本发明利用生物信息学手段，从影响PCR检测灵敏度的各种因素入手分析基因片段结构，筛选出最容易通过PCR扩增出的基因片断作为PCR检测靶点，从引物质量参数方面进行分析，设计扩增这些靶点基因的引物；进一步利用设计的两对对引物分别扩增TGEV、PEDV的特异性序列，以TGEV和（或）PEDV疑似感染样品提取RNA,进一步发转录成cDNA,以cDNA为扩增模板，建立了对猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻感染鉴别诊断的二重PCR体系。其具体技术方案描述如下。

本发明提供一种传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒的二重PCR方法，具体步骤包括：

（1）从感染TGEV、PEDV的阳性肠管组织提取RNA，反转录成cDNA，进一步以cDNA为模版，将分别针对TGEV和PEDV的2对引物同时加入PCR反应体系，进行PCR扩增；

（2）PCR结束后，对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析，得到385bp特异性基因片段表示感染猪传染性胃肠炎病毒，得到628bp特异性基因片段表示感染猪流行性病毒；其中：

步骤（1）中2对引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：

上游引物TGEV：5’CAACCCCGATGGAGCACT3’；

下游引物TGEV：5’CCGAA CATTA CATAT CTGGA CACT3’；

上游引物PEDV：5’TGAGG GTGACAAGTTCGTAGG3’；

下游引物PEDV：5’CGCCA AGATATTAAAAGATTCACC3’；