[发明专利]一种提高黄芩毛状根黄芩苷产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种提高黄芩毛状根黄芩苷产量的方法。

背景技术

黄芩是常用药材品种，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。其主要有效成分黄芩苷和黄芩素具有显著的解热、抑菌、镇静、降压等作用，因此以黄芩为原料的中药有效成分提取厂家纷纷崛起，加之各种黄芩成药产品的广泛开发，特别是双黄连、银黄系列，黄芩的年销量急剧增加。加上近年来国家出台了一系列保护野生资源的政策，致使可用野生黄芩资源日渐萎缩，而家种黄芩的种植面积也因价格和经济利益的因素得不到明显的扩大，并且家种黄芩存在药残风险。这些因素导致了黄芩药材出现紧缺、供不应求的现状。因此，亟需开发出一条新的、行之有效的黄芩药材及有效成分药源新途径。而在众多的应对措施中，黄芩毛状根的培养及有效成分积累和代谢调控越来越受到人们的关注，并且其在生产周期、有效成分积累和农药激素残留等方面显示出了独特的优势。

上世纪80年代以后，随着植物生物技术的发展，有关毛状根的研究十分迅速，除了探求外源基因导入植物细胞的机制和植物激素的生理效应外，应用毛状根生物技术诱导植物次生代谢产物的形成与生物转化等研究也有很大发展，这一生物技术为植物有效成分的大量生产提供了新的途径，越来越引起人们的重视。到20世纪末，国内外学者已建立了分属于31个科的100余种植物的毛状根培养体系，并进行次级代谢产物的生产和调控，包括苷类、生物碱、醌类、芳香油、酚类、黄酮等多种天然产物。毛状根培养技术已被认为是生产药用植物次生代谢产物的一条重要途径，具有非常广泛的应用前景。Nishikawa等将发根农杆菌ATCC15834含有的Ri质粒中的T-DNA片段整合到黄芩愈伤组织，诱导出毛状根，进行黄芩的毛状根培养，从而提高黄芩的次生代谢产物的产量。而国内对黄芩毛状根的培养研究工作开展的相对较晚。2006年，齐香君等利用激素诱导黄芩无菌苗外植体(带节茎段)，并通过发根农杆菌（1.2556、A49615和A4野生型）诱导得到黄芩毛状根，经过培养条件优化采用2L鼓泡式反应器对黄芩毛状根的扩大培养做了初步的尝试，发现毛状根生长量为14.9g/L，黄芩苷含量为5.16%、产量为0.77g/L，其生长量略高于摇瓶培养，黄芩苷含量偏低。2009年李雅等建立了三级黄芩毛状根的培养体系，毛状根的生物量为11.52g/L，黄芩苷含量为20.99%。

目前，已有少数单位正在利用低能离子束生物技术对药用植物育种工作展开研究，并已取得明显成效，新疆大学离子束生物工程实验室对低能离子注入麻黄种子生物效应进行了初步研究，结果表明：离子注入对麻黄种子的生长起良好的生物效应；内蒙古大学离子束生物工程重点实验室正开展以药用植物为对象，用离子束生物技术进行品种改良的系列研究。但是目前，尚没有关于将离子束用于毛状根品质改良的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高黄芩毛状根黄芩苷产量的方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1）黄芩毛状根预培养

将黄芩毛状根以5～10g/L的接种量接种于改良的MS液体培养基中，然后于25～28℃避光培养4～6天，所述改良的MS液体培养基为添加有0.4～0.6mmol/L苯丙氨酸以及60～70g/L蔗糖的MS液体培养基；

2）毛状根的处理

将150～200mg经过预培养的黄芩毛状根在无菌条件下剪切成1.5～2cm的毛状根片段，将毛状根片段放置于无菌的培养皿中，然后用无菌风将培养皿中的毛状根片段吹干，然后将培养皿放入离子注入机靶室中对毛状根片段进行低能离子束注入；

3）以经过低能离子束注入后的毛状根片段为黄芩毛状根种子，对黄芩毛状根种子进行扩大培养。

所述低能离子束注入的条件为：注入离子为N⁺，注入剂量为2.5×10¹⁶～3.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量为15～25KeV，脉冲时间为5～10s，间隔时间为5～10s。

所述扩大培养具体包括以下步骤：

1）种子培养