[发明专利]一种用产丁二酸重组大肠杆菌细胞制备富马酸的方法

权利要求书

1.一种用产丁二酸重组大肠杆菌细胞制备富马酸的方法，其步骤如下：

(1)利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸；

(2)丁二酸发酵结束时，采用沉降法收集菌体回收细胞，回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞；

(3)将回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞，转入新鲜培养基中，通空气或者氧气，并维持60％的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在36℃和7.5，其中，所述的步骤(3)中的新鲜的培养基为JSM-CN培养基；

所述低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞是指经过厌氧发酵36h或48h后回收的细胞；

所述JSM-CN培养基是指以JSM发酵培养基为基础，去除葡萄糖、磷酸氢二铵、氯化铵和硫酸铵；

所述重组大肠杆菌为菌株Escherichia coli AFP111。

2.根据权利要求1所述的制备富马酸的方法，其特征在于：所述的步骤(1)具体操作为：活化重组大肠杆菌菌体，转接入发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为20-30g·L^-1，培养过程溶氧维持在40％～60％；待葡萄糖基本消耗完时改通CO₂气体，进入厌氧发酵产酸阶段，发酵过程中补加葡萄糖，且控制葡萄糖浓度在5～20g·L^-1，同时添加二氧化碳供体，调控pH值在6.8-7.0之间。

3.根据权利要求2所述的制备富马酸的方法，其特征在于：所述的活化重组大肠杆菌菌体为从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下至菌体密度的OD₆₀₀值在0.6～0.8之间。

4.根据权利要求1所述的制备富马酸的方法，其特征在于：所述的步骤(2)具体操作为待发酵结束时，发酵罐内停止通气与搅拌，静置5～10分钟，待细胞沉降完全后，通过压缩空气给罐子增压，通过压差将发酵罐内菌体细胞上层的发酵清液移除；或者在发酵罐外面用泵将发酵罐内的上层清液抽出发酵罐即可实现菌体的收集。