[发明专利]一种用产丁二酸重组大肠杆菌细胞制备富马酸的方法

说明书

本发明公开了一种产丁二酸重组大肠杆菌细胞的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明步骤如下：（1）利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸；（2）丁二酸发酵结束时，采用沉降法收集菌体回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞；（3）将回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞，转入新鲜培养基中，通空气或者氧气，并维持40%～60%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在33℃～36℃和6.8～7.5。本发明回收细胞的方式由于就在原发酵罐内进行，因此可以大大降低染菌的几率以及减少对细胞的损伤。细胞回收率最高可达91%。以回收的低活性的产丁二酸重组大肠杆菌为催化剂，丁二酸钠为底物，有氧转化合成富马酸，其转化率达到92%以上。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用产丁二酸重组大肠杆菌细胞制备富马酸的方法。

背景技术

当前微生物发酵产丁二酸研究所涉及的微生物，主要有野生型的微生物以及基因工程菌。利用大肠杆菌来发酵生产丁二酸，是利用了大肠杆菌生长快速、培养条件简单、安全性好、易操作易改造等诸多优点。目前利用大肠杆菌发酵生产丁二酸主要采取的是两阶段发酵、纯厌氧发酵以及纯好氧发酵的工艺。

目前细胞回收一般采用的工艺为离心分离或者膜分离手段，这两种操作比较麻烦且容易染菌，回收细胞的时间较长，容易造成细胞活力下降的现象。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在产丁二酸重组大肠杆菌发酵结束时，通过一种温和、高效的方法回收菌体细胞。

为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：

(1)利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸；

(2)丁二酸发酵结束时，采用沉降法收集菌体回收细胞回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞；

(3)将回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞，转入新鲜培养基中，通空气或者氧气，并维持40％～60％的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在33℃～36℃和6.8～7.5。

所述的步骤(1)具体操作为：用活化重组大肠杆菌菌体，转接入发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为20-30g·L^-1，培养过程溶氧维持在40％～60％以上；待葡萄糖基本消耗完时改通CO₂气体，进入厌氧发酵产酸阶段，发酵过程中补加葡萄糖的方法，且控制葡萄糖浓度在5～20g·L^-1，同时添加用于提供二氧化碳供体，调控pH值在6.8-7.0之间。

所述的活化重组大肠杆菌菌体为从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下至菌体密度的OD600值在0.6～0.8之间。

所述的步骤(2)具体操作为待发酵结束时，发酵罐内停止通气与搅拌，静置5～10分钟，待细胞沉降完全后，将菌体细胞上层的发酵清液通过压缩空气给罐子增压通过压差将发酵罐内的上层清液移除；或者在发酵罐外面用泵将发酵罐内的上层清液抽出发酵罐即可实现菌体的收集。

所述的步骤(3)中的新鲜的培养基为JSM-CN培养基、JSM-CP培养基、JSM-CT培养基。

添加葡萄糖至初始浓度为20-30g·L^-1，培养过程溶氧维持在40％～60％；待葡萄糖基本消耗完时改通CO₂气体，进入厌氧发酵产酸阶段，发酵过程中补加葡萄糖的方法，且控制葡萄糖浓度在5～20g·L^-1，同时添加用于提供二氧化碳供体，调控pH值在6.4-7.0之间。