[发明专利]一种猪乙型脑炎病毒纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒纯化方法，尤其涉及一种猪乙型脑炎病毒纯化方法。

背景技术

流行性乙型脑炎是由黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的一种人兽共患的疾病。猪被认为是本病最重要的自然增殖动物，能引起怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，公猪发生睾丸炎；临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。猪乙型脑炎流行不仅给养猪业造成严重危害，而且还严重威胁人类健康。

疫苗是预防该病的主要方法之一。目前，我国商品化的猪乙型脑炎疫苗主要是鼠脑灭活疫苗和弱毒疫苗。其中以弱毒疫苗为主，其安全性和有效性主要受病毒滴度和抗原纯净性等因素的影响。商品化疫苗如果直接以细胞繁殖的病毒液进行成品苗的生产，会受到细胞破碎产物，培养基成分，细胞代谢产物等杂质的影响，致使疫苗免疫动物后易发生过敏反应，发热反应等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原纯净性是提升疫苗质量基本途径。

中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术（Tangential Flow Filtration,TFF）的范畴，又称错流过滤（Cross-Flow Filtration，CFF）：料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。

和传统的平板膜包相比，中空纤维柱具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。

目前，对于猪乙型脑炎病毒的中空纤维澄清纯化及浓缩工艺尚无报道。

发明内容

本发明旨在解决现有猪乙型脑炎病毒疫苗均一性差、免疫效果差等技术问题，提供一种使用微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统实现的猪乙型脑炎病毒纯化方法。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪乙型脑炎病毒纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，过程如下：

1系统的组装

无菌条件下，将微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统按照组装要求进行组装。在微滤澄清纯化系统中可安装无菌0.45μm或0.65μm、完整无损的中空纤维微滤膜，在超滤浓缩纯化系统中可安装无菌100KD或300KD、完整无损的中空纤维超滤膜。

2系统完整性检测

压力保持法检测系统的完整性。

3系统的处理

3.1清洗及灭菌

将0.5M NaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。

3.2水洗及通量检测

灭菌结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无菌超纯水注满系统的进料罐，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。

3.3PBS处理

水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。

上述所述技术方案中，步骤3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、灭菌作用，也可选用50%～80%的酒精溶液，或采用蒸汽灭菌的方式进行系统灭菌。

一种猪乙型脑炎病毒纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，该方法包括以下步骤：

1）将无菌吐温20按0.5%～10%(v/v)的比例加入猪乙型脑炎病毒液中，振荡处理；

2）将步骤1）振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45或0.65μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

3）以1:1(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第一洗滤液待用；

4）以1:1(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3）处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第二洗滤液待用；

5）以1:1(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4）处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第三洗滤液待用；