[发明专利]一种提高全细胞转化生产α‑酮戊二酸产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过敲除sucA基因提高重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法，属于生物技术领域。

背景技术

α-酮戊二酸是三羧酸循环的重要中间体，对于协调细胞内碳代谢和氮代谢发挥重要作用。α-苯丙酮酸有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗氧化剂及促进伤口愈合。在生物医学诊断中，α-酮戊二酸可作为酮戊二酸脱氢酶，天冬氨酸转氨酶及丙氨酸转氨酶的底物。α-酮戊二酸可作为合成聚乙烯的原材料，这种聚合物具有生物降解能力。传统α-酮戊二酸生产采用化学法，化学法的主要缺点是缺乏选择性，采用有毒的氰化物及金属铜，产率低，且污染环境。酶和全细胞生物催化剂越来越多的用于工业化生产。

L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α-酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。蛇毒氨基酸脱氨酶是研究最好的脱氨酶，但是价格昂贵，难以大规模使用。P.mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。

通过PCR和Cre/loxP定点重组系统结合进行基因重组操作，实现了枯草芽孢杆菌内不依赖载体构建的无痕敲除过程。

全细胞转化相比分离酶具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。之前的研究中我们已经成功构建了枯草芽孢杆菌全细胞催化剂，表达来源于P.mirabilis KCTC2566的改造的脱氨酶基因，α-酮戊二酸的产量为8.59g/L。但是由于全细胞催化剂本身对底物有一定吸收，用于胞内分解代谢消耗，从而影响了胞外底物转化生成α-酮戊二酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题是解决全细胞催化剂本身对L-谷氨酸的吸收浪费，从而提高胞外转化L-谷氨酸的产量。是将sucA基因敲除，从而阻断胞内L-谷氨酸的分解途径，以此改造菌株高效转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸，从而解决了工业化α-酮戊二酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。本发明以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，敲除其基因组中sucA基因。

所述重组枯草芽孢杆菌为表达的改造后L-氨基酸脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌168。

所述改造后L-氨基酸脱氨酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的突变体为F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T

所涉及到的微生物有：P.mirabilis KCTC2566、B.subtilis168。

所涉及到的质粒有：p7Z6(pMD18-T containing lox71-zeo-lox66cassette)、pTSC(Em^r Amp^r;temperature sensitive in B.subtilis)，均系本实验室保存。

所述sucA基因敲除方法：PCR扩增sucA基因上下游约1000bp及抗性标记片段约1000bp，融合PCR制备打靶片段。将此融合产物转化枯草感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株。最后用温敏型质粒消去抗性。所述sucAGENBANK ID：939507。

所述微生物菌株的种子培养与发酵培养基：种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，自来水定容至100mL。发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH₂PO₄和72mmol/L K₂HPO₄的溶液（2.31g的KH₂PO₄和12.54g的K₂HPO₄溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌）。