[发明专利]一种蕲蛇提取物及其应用

权利要求书

1.一种蕲蛇提取物，其特征在于所述蕲蛇提取物按如下方法制备：（1）糖皮质激素受体蛋白制备：向含糖皮质激素受体基因的重组工程菌经发酵培养获得的发酵液中加入IPTG进行诱导培养，获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀经超声破碎后提取蛋白，获得糖皮质激素受体蛋白；所述糖皮质激素受体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；（2）蕲蛇提取物：将步骤（1）制备的糖皮质激素受体蛋白偶联到Ni-NTA Agarose柱作为固定相，再将蕲蛇水煎剂作为流动相流经Ni-NTA Agarose柱，然后PBS洗涤柱子两次，加入IgG Elution Buffer洗脱液进行洗脱，收集流出液，获得蕲蛇提取物；所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备：将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1：100混合后煎煮至原料体积的5%，过滤，滤液冷冻干燥后用pH值为7的磷酸缓冲液溶解，过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。

2.如权利要求1所述蕲蛇提取物，其特征在于步骤（1）所述重组工程菌发酵培养的方法为：将含糖皮质激素受体基因的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1%的接种量接种至LB液体培养基中，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，获得发酵液。

3.如权利要求2所述蕲蛇提取物，其特征在于步骤（1）所述发酵液诱导培养的条件为：向发酵液中加入终浓度1mM的IPTG，在15℃、200rpm条件下诱导培养12h，获得诱导培养液。

4.如权利要求1所述蕲蛇提取物，其特征在于步骤（1）所述蛋白提取方法为：将诱导培养液离心，收集沉淀用pH值为7的磷酸盐缓冲液制成菌悬液，在菌悬液中加入终浓度1mM的苯甲基磺酰氟，在功率300W、温度4℃条件下超声破碎10s，间隔10s，超声10min，离心，弃去上清液，沉淀加入尿素溶解液和苯甲基磺酰氟吹打均匀后振荡，冰置5min，重复振荡和冰置4次，离心，取上清，获得糖皮质激素受体蛋白；所述尿素溶解液每50mL的配制方法为：尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，加蒸馏水定容至50mL。

5.如权利要求1所述蕲蛇提取物，其特征在于步骤（2）所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备：将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1：100混合后煎煮至原反应液体积的5%，过滤，滤液在-20℃冷冻干燥后制成粉末，然后用pH值为7的磷酸缓冲液溶解，用0.25μM微孔滤膜过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。

6.如权利要求1所述蕲蛇提取物，其特征在于所述蕲蛇提取物按如下方法制备：（1）糖皮质激素受体蛋白：将含糖皮质激素受体基因的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1%的接种量接种至LB液体培养基中，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，向培养液中加入终浓度1mM的IPTG，在15℃、200rpm条件下诱导培养12h，获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀用pH值为7的磷酸盐缓冲液制成菌悬液，在菌悬液中加入终浓度1mM的苯甲基磺酰氟，在功率300W、温度4℃条件下超声破碎，超声10s，间隔10s，超声10min，离心，弃去上清液，沉淀加入尿素溶解液和苯甲基磺酰氟，吹打均匀后振荡，冰置5min，重复振荡和冰置4次，12000rpm，离心10min，离心后取上清液，获得糖皮质激素受体蛋白；所述尿素溶解液每50mL的配制方法为：尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，加蒸馏水定容至50mL；（2）蕲蛇提取物的制备：将步骤（1）制备的糖皮质激素受体蛋白偶联到Ni-NTA Agarose柱作为固定相，将蕲蛇水煎剂作为流动相流经偶联受体蛋白的Ni-NTA Agarose柱，然后PBS洗涤柱子两次，加入IgG Elution Buffer洗脱液进行洗脱，收集流出液，获得蕲蛇提取物；所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备：将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1：100混合后煎煮至原料体积的5%，过滤，滤液在-20℃冷冻干燥后粉碎成粉末，然后用pH值为7的磷酸缓冲液溶解，用0.25μM微孔滤膜过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。

7.一种权利要求1所述蕲蛇提取物在制备糖皮质激素类抗炎药物中的应用。