[发明专利]一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法

权利要求书

1.一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法，其特征是包括以下步骤；

a、粗孔微球硅胶的活化：

将粗孔微球硅胶浸入20%的盐酸中浸泡8h，然后用蒸馏水洗涤，真空干燥；

b、酶-硅胶混合液的共沉淀：

称取步骤a中活化的粗孔微球硅胶50-150mg，缓慢加入苯丙氨酸解氨酶酶液中，缓慢搅拌10min，然后加入硫酸铵粉末，边加入边搅拌,使得最终硫酸铵的质量百分浓度达到40%，得到酶-硅胶混合液的共沉淀聚体悬浮液；

c、酶-硅胶混合液的共沉淀聚体的共价交联：

向步骤b所得酶-硅胶混合液的共沉淀聚体悬浮液中加入戊二醛水溶液，令最终戊二醛的体积百分浓度为0.1-0.3%，在4-25℃条件下搅拌交联1-3h，得到共价交联的混合物；

d、以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的回收和保存：

将步骤c得到的共价交联的混合物在4-25℃条件下静置1-5min，取固体沉淀用Tris-HCl缓冲液洗涤3次，直至上清溶液中检测不出来苯丙氨酸解氨酶活性，冷冻真空干燥，得苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体，最终将干燥后的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体保存在4℃；

所述的Tris-HCl缓冲液摩尔浓度为50mmol/L,pH值为8.8。

2.如权利要求1所述的一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法，其特征是，所述步骤a粗孔微球硅胶的活化包括以下具体步骤：

准确称取5g粗孔微球硅胶，浸入50mL20%的盐酸中浸泡8h，所述的粗孔微球硅胶颗粒的粒径范围为2-5mm；在4℃条件下，以3000r/min离心5min，弃去上清，获得的沉淀用蒸馏水洗涤3次，干燥后得到活化的粗孔微球硅胶，所述的干燥为真空冷冻干燥。

3.如权利要求1所述的一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法，其特征是，所述步骤b酶-硅胶混合液的共沉淀包括以下具体步骤：

将苯丙氨酸解氨酶粉溶解于Tris-HCl缓冲液中制成质量百分浓度为10mg/ml的酶液，往1ml酶液中缓慢加入步骤a中所述的活化粗孔微球硅胶100mg，缓慢搅拌10min，然后往酶液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加入边搅拌，使得最终硫酸铵的质量百分浓度达到40%，然后在4℃条件静置5min，使苯丙氨酸解氨酶沉淀，制备出酶-硅胶混合液的共沉淀聚体悬浮液。

4.如权利要求1所述的一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法，其特征是，所述步骤c酶-硅胶混合液的共沉淀聚体的共价交联包括以下具体步骤：

向步骤b所得酶-硅胶混合液的共沉淀聚体悬浮液中加入戊二醛溶液，控制戊二醛溶液终浓度为体积百分比的0.2%，4℃条件下搅拌交联3h，得到以粗孔微球硅胶为内核的酶聚体共价交联物。

5.如权利要求1所述的一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法，其特征是，所述步骤d中，将步骤c得到的以粗孔微球硅胶为内核的酶聚体共价交联物在25℃条件下静置5min。