[发明专利]一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物化工技术领域，涉及一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法。

背景技术

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL)是一种水解酶，是生物化工领域酶法生产L-苯丙氨酸(L-Phe)和对香豆酸的关键酶。L-Phe和香豆酸是重要的医药和食用化学品中间体。游离的PAL存在稳定性差、易失活、无法重复使用，反应后难以从产物中分离等问题。因此，将其工业化大规模生产仍存在较大困难。研究表明，固定化后的PAL具有能回收、可重复使用、操作性能好、产物易分离、适用于大规模酶反应器等优点，在生产中具有很大应用前景。近年来，出现了一种新型固定化酶方法-交联酶聚体技术（Cross-linked enzyme aggregatres technology,CLEAs)，它是一种利用盐等沉淀剂沉淀酶蛋白获得酶聚集体，然后用双功能交联剂对酶聚集体进行交联制备交联酶聚体（CLEAs)的方法。与游离酶相比，该方法获得的固定化酶具有稳定性好、可重复使用等优点。Matijosyte等以二氧六环为沉淀剂沉淀漆酶，然后用戊二醛交联，得到的CLEAs酶活回收率达到了150%以上（Matijosyte I,Isabel W.C.E,Arends B,et al.Preparation and use of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs)of laccases.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2010,62(2):142-148.）。Yan等用PEI作为沉淀剂，制备了脂肪酶PEI-CLEAs。相比于传统的交联酶聚体，该固定化酶酶活回收率从12%提高到42%；在50～55℃处理4h后，酶活保留率达65%；反应5个批次之后，酶活保留率为72%。并且，PEI-CLEAs在制备甘油酯产品的过程中也表现出了良好的性能（Yan J.Y,Gui X.H,Wang G.L.Improving stability and activity of cross-linked enzyme aggregates based on polyethylenimine in hydrolysis of fish oil for enrichment of poly-unsaturated fatty acids.Applied Biochemistry and Biotechnology,2012,166(4):925-932.)。目前，从反应产物中分离回收CLEAs主要是利用离心和过滤的方法实现。但是，通过离心或过滤后，CLEAs颗粒会凝聚成致密的团块，造成酶促反应时传质阻力，底物难以进入酶活性中心进行反应，从而导致催化效率下降。而且，反复的离心或过滤需要消耗大量能量，增加了生产成本。因此，如果能找到解决上述问题的技术方法，不但对酶法高效生产L-Phe以及对香豆酸具有极其重要的意义，而且对于其他酶的高效应用也将产生重要的借鉴意义。

发明内容

本发明的目的为针对现有技术的不足，提供一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法，它能克服传统交联酶聚体需要反复的离心或过滤所导致交联酶聚体凝聚成块的问题，以提高催化效率等。

本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明一种以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备方法，包括以下步骤；

a、粗孔微球硅胶的活化：

将粗孔微球硅胶浸入20%的盐酸中浸泡8h，然后用蒸馏水洗涤，真空干燥；

b、酶-硅胶混合液的共沉淀：

称取步骤a中活化的粗孔微球硅胶50-150mg，缓慢加入苯丙氨酸解氨酶酶液中，缓慢搅拌10min，然后加入硫酸铵粉末，边加入边搅拌,使得最终硫酸铵的质量百分浓度达到40%，得到酶-硅胶混合液的共沉淀聚体悬浮液；

c、酶-硅胶混合液的共沉淀聚体的共价交联：

向步骤b所得酶-硅胶混合液的共沉淀聚体悬浮液中加入戊二醛水溶液，令最终戊二醛的体积百分浓度为0.1-0.3%，在4-25℃条件下搅拌交联1-3h，得到共价交联的混合物；

d、以粗孔微球硅胶为内核的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的回收和保存：

将步骤c得到的共价交联的混合物在4-25℃条件下静置1-5min，取固体沉淀用Tris-HCl缓冲液洗涤3次，直至上清溶液中检测不出来苯丙氨酸解氨酶活性，冷冻真空干燥，得苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体，最终将干燥后的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体保存在4℃；