[发明专利]由壳聚糖凝胶微球制备的固定化多功能淀粉酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种由壳聚糖凝胶微球制备的固定化多功能淀粉酶及其制备方法。

背景技术

多功能淀粉酶是α-淀粉酶家族中的一个亚家族，它们同时具有多种催化活性，包括水解α-1,4糖苷键或α-1,6糖苷键，转糖苷形成α-1,4糖苷键或α-1,6糖苷键。目前已经发现的多功能淀粉酶多数是嗜热酶或中温酶，它们的催化性质比较接近，分子量一般在60kD～70kD。

多功能淀粉酶对人类的健康和生活具有重要的意义，并在工业生产中可最大限度地节约资源，可以催化淀粉降解、转化，生成具有重要生理功能的异麦芽低聚糖和麦芽低聚糖产物。异麦芽低聚糖已被公认为是双歧杆菌的生长促进因子，具有重要的生理功能和药用价值，因此多功能淀粉酶在食品和医药工业中具有非常重要的意义。

壳聚糖是从甲壳类动物、昆虫外壳和真菌的细胞壁中提取的一种氨基多糖（2-氨基-2,4-β葡聚糖），是自然界中唯一的一种碱性多糖，呈网状结构。由于壳聚糖来源丰富、制备简单、价格低廉，并具有诸多优良特性，如生物兼容性、生理惰性、无毒副性、抗菌性、良好的机械性，以及可天然降解且降解产物亦无毒等，因此长期以来一直是用作固定化酶的良好载体。

当前以壳聚糖为载体用于酶的固定化的形态主要有无定型、薄膜、纳米尺度、微球，其中以壳聚糖微球在酶固定化中的应用最为普遍。制备壳聚糖微球的方法有：中和滴定法、乳化交联法、化学交联沉淀法、离子凝胶法、溶剂蒸发法、喷雾干燥法等。中和滴定法制备的壳聚糖微球为凝胶微球，结构疏松多孔并在表面保留了大量的氨基，易于与戊二醛等共价连接形成手臂。这些特性使壳聚糖微球成为固定化酶的优选载体之一。

酶的化学本质是蛋白质，各种理化因素均有可能使酶丧失生物活力。酶从天然体系中分离出来后，稳定性会降低甚至会很快失去活力，或在催化反应完成后很难从反应体系中分离出来，不易回收，而且随着反应的继续，理化条件的改变会使酶的催化速率迅速下降，这些现象制约了酶在现代工业中的应用。固定化酶是通过适当的方法将酶固定在一定的固相载体上，在最大限度地保持游离酶功能结构的同时能够实现回收和重复利用，解决了游离酶在实际应用中的诸多限制。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种制备简单、成本低廉、安全无毒的固定化多功能淀粉酶及其制备方法。本发明采用中和滴定法制备特定的壳聚糖凝胶微球，制备得到的壳聚糖凝胶微球大小均一，机械强度好，且无毒副作用，适合应用于食品及医药领域。以所制备的特定壳聚糖凝胶微球为载体，在适合多功能淀粉酶活性稳定的特定条件下固定多功能淀粉酶，得到稳定的固定化多功能淀粉酶。

本发明所述的一种由壳聚糖凝胶微球制备的固定化多功能淀粉酶，是以壳聚糖凝胶微球为载体，多功能淀粉酶通过共价键固定在壳聚糖凝胶微球上，壳聚糖凝胶微球上多功能淀粉酶的载酶蛋白数量为0.6～0.7毫克/克。

应用本发明的固定化多功能淀粉酶催化淀粉的降解，可得到葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖和异麦芽四糖。本发明的固定化多功能淀粉酶具有酶活力稳定，酶的性能保持好，宜于储存，制备方法简单，成本低廉等优点。

本发明所述的多功能淀粉酶是从嗜温菌Bacillus sp.ZW2531-1[参考文献：王阳，李樊，高朝辉，郑晓一，张应玖.一株产新型淀粉酶的嗜温菌ZW2531-1的分离与鉴定.吉林大学学报(理学版).2008,46(4):779-783]中制备的一种耐热酶[参考文献：Fan Li（李樊）,Xuejun Zhu（朱学军）,Yanfei Li（李雁飞）,Hao Cao（曹昊）,and Yingjiu Zhang（张应玖）.Functional characterization of a special thermophilic multifunctional amylase OPMA-N and its N-terminal domain（一种特殊的耐热性多功能淀粉酶及其N端结构域的功能特性）.Acta Biochim Biophys Sin（生物化学与生物物理学报）.2011,43(4):324–334）]，其比活力为12.82活力单位/毫克。

本发明提供的用中和滴定法制备的壳聚糖凝胶微球固定化多功能淀粉酶的制备方法，包括下列步骤：

（1）初级壳聚糖凝胶微球的制备