[发明专利]青花菜品种台绿1号杂交种的快速鉴定方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种青花菜品种‘台绿1号’杂交种的快速鉴定方法。 

（二）背景技术

青花菜（Brassica oleracea var.italica），又名绿花菜、西兰花等，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种。其食用部分是带有花蕾群的肥嫩花茎，营养丰富，风味独特，而且具有抗癌和抗氧化功效，深受广大消费者的喜爱。近年来我国青花菜栽培面积逐年增加，对优势青花菜品种的需求也不断加大，利用杂种优势生产青花菜F₁杂交种已经成为一种趋势。但是，在杂交种制种过程中母本自交，人们操作过程的相互传粉，鸟类、蜜蜂等造成的串粉都会形成假杂种，再加上青花菜杂交种种粒小且品种之间差异小，在收获、脱粒、加工、贮藏、包装、销售的过程中也容易造成混杂。目前育种者主要依靠常规大田种植对青花菜杂交种进行鉴定，但其周期长且费工、占地，易受季节限制，对当年生产的杂交种纯度难以确定，对因环境条件影响所引起的变异与本品种遗传所产生的变异区分较困难，不适应当前生产的需要。植物品种之间的差异归根结底是基因的差异，利用现代分子生物学手段从遗传基础上鉴定杂交种的真伪更加符合市场需求。 

ISSR（Inter-simple sequence repeats）是一种可在没有任何分子生物学研究基础的情况下开展的新型DNA分子标记技术，它利用生物基因组中广泛存在的简单重复序列SSR（Simple Sequence Repeat）设 计引物，通过PCR方法扩增基因组中两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的区段，所获得的多个条带通过琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，无需预先克隆和测序。与SSR相比，ISSR在不同物种之间的通用性更强且引物开发更加容易，与RAPD相比，稳定性更高，是一种操作简单、成本低廉的检测手段，目前研究者已经利用ISSR进行水稻、黄瓜等多种作物的杂交种纯度鉴定，但是将ISSR应用于青花菜杂交种遗传纯度鉴定的却未见报道。 

台绿1号’【浙(非)审蔬2011004】是台州市农科院利用材料‘Br60-2-2-1-2’和‘B19-10-1-2-1’配组育成的中晚熟品种，该品种生长势较强，侧枝较少，花球高圆且紧实，球面圆整，蕾粒中细均匀，花球外观商品性好，采收期长，适宜于可做保鲜和速冻加工，适合在台州、宁波及萧山等青花菜重要产区种植，具有较好的推广前景。为保证‘台绿1号’的种子纯度，规范青花菜杂交种种子产业，保证农业用种质量，建立一套准确、快速、高效、低成本、易推广的青花菜杂交种遗传鉴定体系具有重要意义。 

（三）发明内容

本发明的目的在于提出一种能够快速、准确、高效地对青花菜品种‘台绿1号’杂交种进行分子鉴定的方法，从而大大提高青花菜商品种的鉴定效率。 

本发明采用的技术方案是： 

青花菜品种‘台绿1号’杂交种的快速鉴定方法，所述方法包括： 

（1）待测青花菜样品的基因组DNA的提取；可采用CTAB简易 

提取法快速提取青花菜幼苗基因组DNA； 

（2）PCR扩增； 

扩增引物（TNISSR15）序列如下： 

5’-TCTCTCTCTCTCTCTCN-3’； 

PCR反应体系每15μL组成如下：待测样品基因组DNA10ng，10μM引物0.85μL，25mM Mg²⁺0.6μL，10mM dNTP0.3μL，5U·μL^-1Taq DNA聚合酶0.15μL，10×buffer1.5μL，无菌重蒸水补齐至15μL； 

PCR反应条件如下：94℃预变性4min，94℃变性0.5min，51℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存； 

（3）结果分析：取PCR产物与含8%（v/v）GelRad核酸染料的loading Buffer混合后上样于2%（w/v）琼脂糖凝胶上，电泳分离后进行凝胶成像，以同时扩增出约800bp和约600bp的条带，判断待测样品为‘台绿1号’杂交种单株；否则不属于台绿1号’杂交种。 

所述方法可进一步包括杂交种纯度计算步骤：根据步骤（3）检测结果计算待测青花菜样品的杂交种遗传纯度，所述杂交种遗传纯度=真杂交种株数÷待测样品株数×100%。 

具体的，所述步骤（1）方法如下：