[发明专利]一株产高产苯丙氨酸的菌株及其生产苯丙氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一株生产L-苯丙氨酸的菌株和利用该菌株生产L-苯丙氨酸的方法。

背景技术

L-苯丙氨酸(L-Phe)是人体内必需的但无法自行合成的八种必需氨基酸之一，其在自然界中普遍存在，却含量较少。L-苯丙氨酸在医疗药品、化妆品、食品及其添加剂领域得到了广泛的应用。尤其是，在甜味剂阿斯巴甜的应用日益广泛，而作为合成甜味剂阿斯巴甜的原料之一的L-苯丙氨酸的市场需求迅速扩大。目前，L-苯丙氨酸的生产方法一般有天然蛋白质水解法、发酵法 、酶法、化学合成法。水解法提取的L-苯丙氨酸含量较低、加工处理复杂、分离提纯较困难，生产成本高；化学合成法生产L-苯丙氨酸路线冗长，产品大多是消旋体，分离纯化较繁琐，污染较大；酶法具有产物浓度高、纯化步骤少、产能力强等优点，但不足之处是原料成本高；发酵法因原料易得且便宜，可以大规模生产，被认为是最经济的方法，被人们广泛使用。

微生物大多数具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌种进行NTG、紫外和离子束等诱变，可以筛选出多种营养缺陷型或抗反馈抑制菌株，从而切断代谢调控中的不必要途径和反馈抑制。L-酪氨酸和L-色氨酸是L-苯丙氨酸代谢支路的主要副产物，对目标产物L-苯丙氨酸合成存在底物竞争性抑制作用。为了解除这种抑制作用，提高L-苯丙氨酸合成效率，Maiti 和Chatterjee以谷氨酸生产菌Arthrobacter globiformis为出发菌株，通过NTG诱变获得L-酪氨酸和L-色氨酸的双重营养缺陷型菌株TT-39，该菌株以葡萄糖为底物可产生L-苯丙氨酸2.6 g/L。由于细菌中L-色氨酸合成量本身就很少，所以目前L-苯丙氨酸生产菌株大多为L-酪氨酸营养缺陷型菌株。例如，中国专利CN 102212569 A公开了一种利用L-酪氨酸营养缺陷型的大肠杆菌生产L-苯丙氨酸的方法。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株简单、高效、安全生产L-苯丙氨酸的菌株。

本发明的第二目的是提供一种上述菌株的获取方法。

本发明第三目的是提供一种利用上述菌株生产L-苯丙氨酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案如下：

一、一株产L-苯丙氨酸的菌株，其特征在于，其分类命名为大肠杆菌WR1001 （Escherichia coliWR1001）已于2013年7月7日保存于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO: M 2013319。

本发明菌株的形态学及生理生化特征如下：

菌落颜色：乳白色偏黄。

菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。

革兰氏染色：阴性。

菌落大小：0.2-0.8×1-4 μm。

需氧方式：好氧生长。

适宜生长温度：35-40 ℃。

适宜生长pH:6.5-7.5。

二、上述大肠杆菌WR1001的获取方法，是以E.coli W3110为出发菌株，通过紫外-氯化锂诱变，离子束注入诱变，初、复筛选得到。

所述的大肠杆菌WR1001的获取方法，具体包括如下步骤：

（1）菌悬液制备

E. coli W3110与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，细菌浓度为10⁶个/mL； 

（2）紫外-氯化锂复合诱变

将步骤（1）的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在100-150 rpm搅拌速度下，进行紫外照射诱变，后取菌悬液涂布于添加氯化锂的完全培养基中，37 ℃下避光倒置培养1 d得到的菌株分别点印于基本培养基、筛选培养基中，培养1d后，挑选仅筛选培养基中生长良好而在基本培养基中不生长的菌株，其菌落形态为圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；

（3）低能离子注入诱变

将步骤（2）中培养后的菌株用无菌水洗涤，菌悬液涂布于无菌空平皿上，制成单层菌液，吹干后，注入氮离子，后洗脱 、涂布到完全培养基上。37 ℃下避光倒置培养1 d得到的菌株分别点印于筛选培养基中，培养1d后，挑选生长良好的菌株，其菌落形态为圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；

（4）初筛

将步骤（3）培养得到的单菌落在LB斜面培养基上培养16 h，活化的菌株在种子培养基搅拌培养8-12 h后按一定接种量转入发酵培养基中，发酵48 h后检测发酵液中L-苯丙氨酸含量，初筛出L-苯丙氨酸含量大于5 g/L的菌落； 

（5）复筛