[发明专利]一种细胞热证模型的建立方法

权利要求书

1.一种细胞热证模型的建立方法；其特征在于：

一、原代肝细胞培养：用75%的酒精擦拭乳鼠，带入超净工作台，冰盘下断头取肝脏，手术刀削除包膜和结缔组织等，PBS（用量：1-2ml）清洗两三次，剪切肝脏成1mm3大小的组织块，再用PBS吹打清洗两三次，待组织块沉淀后弃上清液，吸取0.20%的胶原酶2ml（以浸过组织块为适宜），放入4℃冰箱静置消化过夜，吸取2ml完全培养液用以终止胶原酶消化，将消化完全的组织块用吸管吹打，吹打过程中力度均匀，尽量不要出现气泡以及尽量避免组织粘附在吸管壁上，吹打后的悬液用200目尼龙网过滤到小烧杯，得到的滤液再次用吸管吹打，吹打后的悬液加入少量完全培养液，4℃冰箱静置20min，在静置过程中血细胞以及细胞碎片大多都悬浮于悬液中，而肝细胞则会沉淀于底部，弃悬液，加入完全培养液1ml，吹打起沉淀的细胞，1000r/min 离心5min，弃上清液，重复操作离心三次，纯化肝细胞，最后一次离心后加入完全培养液吹细胞，将吹打均匀的细胞悬液等量的转移到培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养，10小时后首次换液，换液时应该缓慢的吸取出上次的培养液，然后贴培养瓶底部添加入新的培养液4ml，以后每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并且拍照，每隔两天换一次培养液，换液量为4ml；

    二、ATP酶活力检测：原代培养的肝细胞在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准为：全量换液，换液量为每孔500μl；经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞培养，所用培养液分别为20%附子含药血清培养液，20%胎牛血清培养液，换液量为500μl，并且做三组平行实验培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清的培养液，

此时所得的细胞即为ATP酶活力检测的实验细胞，将培养板上的贴壁肝细胞用细胞刮沿壁轻轻地刮下来，收集好每个培养孔里的悬液，然后在倒置显微镜下采用血球计数板和细胞计数器进行细胞计数，将收集好各组细胞储备于塑料离心管里，然后置于超声波细胞粉碎机进行超声波细胞破碎，破碎后的细胞即可用于试剂盒检测，附子含药血清组与胎牛血清组组相比，原代肝细胞Na＋- K＋- ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05），附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞Ca2＋- Mg2＋- ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05）；附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞T-ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05）；

    三、ATP含量及其能荷测定：将附子含药血清干预培养后的原代肝细胞用细胞刮从培养板中收集后细胞计数不少于1×106，1000r/min离心5min，制成混悬液，然后分别加入蛋白沉淀剂沉淀蛋白，再次4000 r/min 离心20min，吸取上清液，4℃储存备用，进样前用0.45μm 微孔滤膜过滤，

精密称取对照品ATP、ADP、AMP适量，加甲醇分别溶解至浓度为0.05mg/ml、0.03mg/ml、0.06mg/ml，4 ℃储存备用，

色谱条件为：流动相：乙腈（A）-50mmol/L磷酸钠（磷酸调PH=7）、10mmol/L四丁基溴化铵（B），其中VA:VB=5:95；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；ATP及能荷计算方法为：ATP含量（μg/g）=样品峰面积×对照品的浓度/（对照品峰面积×样品浓度）；ADP含量（μg/g）=样品峰面积×对照品的浓度/（对照品峰面积×样品浓度）；AMP含量（μg/g）=样品峰面积×对照品的浓度/（对照品峰面积×样品浓度）；能荷=(ATP+0.5×ADP)/(ATP+ADP+AMP)，附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞的ATP含量显著升高，差异具有显著性（P<0.05）；原代肝细胞的能荷显著升高，差异具有显著性（P<0.05），

  四、游离钙浓度检测：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养；在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准为:全量换液，换液量为每孔500μl；经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞培养，所用培养液分别为20%附子含药血清培养液，20%胎牛血清培养液，换液量为500μl，并且做三组平行实验；培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清的培养液；然后每孔中滴加200μl Fluo-3/AM工作液进行细胞染色；将培养板置于37℃的二氧化碳培养箱中避光孵育30分钟；去除Fluo-3/AM工作液，用PBS冲洗2次，加入200μl培养液，将培养板用锡纸包裹避光，室温放置30min，用激光共聚焦显微镜分别在10倍、20倍视野里观察染色细胞的形态，并且做好实验数据的记录，附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞内游离钙浓度显著升高，差异具有显著性，且具有统计学意义（P<0.05）；

    五、细胞膜电位检测：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养；在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准为:全量换液，换液量为每孔500μl；经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞培养，所用培养液分别为20%附子含药血清培养液、20%大黄含药血清培养液、20%胎牛血清培养液、20%空白含药血清培养液，换液量为500μl，并且做三组平行实验；培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清的培养液；然后每孔中滴加200μlFluo-3/AM工作液进行细胞染色；将培养板置于37℃的二氧化碳培养箱中避光孵育30分钟；去除Fluo-3/AM工作液，用PBS冲洗2次，加入200μl培养液，将培养板用锡纸包裹避光，室温放置30min，用激光共聚焦显微镜分别在10倍、20倍视野里观察染色细胞的形态，并且做好实验数据的记录，在200倍镜头下，附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞膜电位显著升高，差异具有显著性，且具有统计学意义（P<0.05）；

经以上方法操作，即可成功建立细胞热证模型。