[发明专利]一种细胞热证模型的建立方法

说明书

技术领域

 本发明涉及细胞药理实验技术领域，特别涉及一种细胞热证模型的建立方法。

背景技术

四性是指药物有寒热温凉四种不同的药性，又称四气。它是中药药性理论的重要组成部分，也是中药区别于植物药、天然药的重要标志。因此，用现代科学知识探讨和阐明药性的本质及药性的发生机制是极为必要的。从上个世纪中叶以来，国内外学者从临床研究、实验研究、文献研究及中药物质基础研究等方面进行了广泛而深入的研究，主要集中在中药四性及其所针对的寒热病症在药物、机体间能量代谢关系、药物整体功效特征、药物对神经系统功能影响、药物基础物质成分、药物对机体内分泌系统功能影响、药物主要活性成分分子量等方面。实践证明，对中药寒热药性属性的规律性认识主要来自于药物作用于人体所产生的反应和所获得的疗效的总结。决定一种中药是寒性还是热性不仅在于哪一种或哪几种物质成分种类、数量的多少，还决定于中药固有物质在体内对相应寒证和热证能不能起到调节作用、起到什么程度的调节作用。以往有关能量代谢的研究主要集中在动物体内实验来。涉及到寒热药性中药对体温、耗氧量、超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶等基础指标，以及从摄入能、消化能、可代谢能等方面探讨寒热药性的影响。为了在细胞水平进行药性的寒热研究，我们运用热性药附子含药血清建立细胞热证模型，拟从细胞水平探索符合中药四性研究的方法与手段，阐示寒热药性的本质及性效发生规律，为更好的指导临床用药奠定基础。

发明内容

本发明的目的是建立热证细胞模型，为从细胞水平进行不同寒热药性对能量代谢的影响提供可靠模型，并可进一步拓展应用于药性其他方面的研究。本发明是体外培养肝原代细胞，加入附子含药血清，通过检测对细胞Na+- K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、T-ATP酶活力，线粒体膜电位，细胞内游离钙离子浓度，ATP含量、细胞能荷等各指标，分析附子含药血清组与正常胎牛血清培养组在肝细胞能量代谢方面的不同影响，从而建立细胞热证模型。具体细胞热证模型的建立方法如下：

    一种细胞热证模型的建立方法：

    一、原代肝细胞培养：用75%的酒精擦拭乳鼠，带入超净工作台，冰盘下断头取肝脏，手术刀削除包膜和结缔组织等。PBS（用量：1-2ml）清洗两三次，剪切肝脏成1mm3大小的组织块，再用PBS吹打清洗两三次，待组织块沉淀后弃上清液。吸取0.20%的胶原酶2ml（以浸过组织块为适宜），放入4℃冰箱静置消化过夜。吸取2ml完全培养液用以终止胶原酶消化，将消化完全的组织块用吸管吹打，吹打过程中力度均匀，尽量不要出现气泡以及尽量避免组织粘附在吸管壁上。吹打后的悬液用200目尼龙网过滤到小烧杯，得到的滤液再次用吸管吹打，吹打后的悬液加入少量完全培养液，4℃冰箱静置20min，在静置过程中血细胞以及细胞碎片大多都悬浮于悬液中，而肝细胞则会沉淀于底部，弃悬液。加入完全培养液1ml，吹打起沉淀的细胞，1000r/min 离心5min，弃上清液。重复操作离心三次，纯化肝细胞。最后一次离心后加入完全培养液吹细胞，将吹打均匀的细胞悬液等量的转移到培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。10小时后首次换液，换液时应该缓慢的吸取出上次的培养液，然后贴培养瓶底部添加入新的培养液4ml。以后每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并且拍照，每隔两天换一次培养液，换液量为4ml。

    二、ATP酶活力检测：原代培养的肝细胞在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准为：全量换液，换液量为每孔500μl；经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞培养。所用培养液分别为20%附子含药血清培养液，20%胎牛血清培养液，换液量为500μl，并且做三组平行实验培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清的培养液。此时所得的细胞即为ATP酶活力检测的实验细胞。将培养板上的贴壁肝细胞用细胞刮沿壁轻轻地刮下来，收集好每个培养孔里的悬液，然后在倒置显微镜下采用血球计数板和细胞计数器进行细胞计数。将收集好各组细胞储备于塑料离心管里，然后置于超声波细胞粉碎机进行超声波细胞破碎。破碎后的细胞即可用于试剂盒检测。附子含药血清组与胎牛血清组组相比，原代肝细胞Na＋- K＋- ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05）。

附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞Ca2＋- Mg2＋- ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05）。附子含药血清组与胎牛血清组相比，原代肝细胞T-ATP酶活力显著升高，差异具有显著性（P<0.05）。