[发明专利]一种产异戊二烯基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产异戊二烯基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。 

技术背景

异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。 

目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。 

生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。 

利用MVA途径和MEP途径生产异戊二烯的反应分别涉及8和9步反应，反应涉及过多的基因。随着分子生物学技术的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。例如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了50微克/克干细胞/天的产率（Pia Lindberg等，2009），但藻类生长缓慢、生物量低下是利用藻类制备异戊二烯的瓶颈问题。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而利用工程菌发酵生产异戊二烯（美国专利公开，2009/0203102）。该工程菌中获得外源MVA途径时需要转入多达8个异源基因，由于过多的异源基因表达可能会导致细胞自身代谢的紊乱，影响细胞的正常生长代谢。 

发明内容

为避免代谢途径过长可能导致的细胞自身代谢紊乱的问题，本发明提出利用可再生资源葡萄糖为原料，通过缩短MVA途径的反应步骤，完成生物催化剂的制备，构建了具有简短的异戊二烯代谢途径的基因工程菌。本发明所采取的技术方案如下： 

一种产异戊二烯的基因工程菌，是在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因得到的重组菌。 

所述基因工程菌的宿主菌是大肠杆菌E.coli BL21(DE3)；所述表达乙酰辅酶A酰基转移酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原 酶基因mvaE，GenBank登录序列号为AAG02438；所述表达3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶的基因是3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录序列号为AAG02439；所述表达末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶的基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT，GenBank登录序列号为ADW41779.1；所述表达油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM，GenBank登录序列号为ACT54545.1。 

本发明还提供了一种利用所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法，是通过化学合成或克隆获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，构建含有上述基因的重组菌，再利用重组菌发酵生产异戊二烯。 

具体地，本发明利用所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法步骤如下： 

1)分别克隆或化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因，末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因和油酸水合酶； 

2)将步骤1）所得的基因连接到表达载体上，获得重组质粒； 

3)将步骤2）所得的重组质粒转化到宿主菌，获得重组菌； 

4)利用步骤3）所得重组菌，发酵生产异戊二烯。 

所述方法步骤1）中所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录序列号为AAG02438。 

所述方法步骤1）中所述3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录序列号为AAG02439。