[发明专利]用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球

权利要求书

1.一种用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，其特征在于：包括磁性微球，磁性微球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的上皮细胞特异性抗体。

2.根据权利要求1所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，其特征在于：所述磁性微球，是表面带有羧基或氨基的具有超顺磁性的磁性微球，直径为1～6μm。

3.根据权利要求1或2所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，其特征在于：所述磁性微球为羧基磁性微球，粒径3～4μm,5mg/ml，表面羧基含量100nmol/g。

4.根据权利要求1所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，其特征在于：所述偶联是指通过共价偶联、疏水作用或者分子间作用力连接在一起。

5.根据权利要求1所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，其特征在于：所述上皮细胞特异性抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体，或核酸适配体。

6.根据权利要求1所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，其特征在于：所述上皮细胞特异性抗体，根据需要捕获的目标肿瘤细胞而选择。

7.根据权利要求1或6所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，其特征在于：需要捕获MCF-7细胞时，所述上皮细胞特异性抗体选用抗EpCAM抗体。

8.权利要求1～7中任一项所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球的制备方法，其特征在于：所用磁性微球为羧基磁性微球时，方法为：

（1）羧基磁性微球的活化：取200μL羧基磁性微球，加入250μL的EDC/NHS溶液，室温下活化30min，磁分离，PBS缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；

（2）羧基磁性微球与抗EpCAM抗体偶联：向上述活化后的磁性微球中加入上皮细胞特异性抗体，室温反应6h，磁分离，PBS缓冲液洗涤，得免疫磁性微球；

所用磁性微球为氨基磁性微球时，方法为：取200μL氨基磁性微球，加入上皮细胞特异性抗体，以及250μL的EDC/NHS溶液，室温反应3h，磁分离，PBS缓冲液洗涤，得免疫磁性微球。

9.根据权利要求8所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球的制备方法，其特征在于：所述上皮细胞特异性抗体为抗EpCAM抗体，加入量及浓度为：50～400μL10μg·mL^-1。

10.利用权利要求1～7中任一项所述的用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球捕获外周血中循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：步骤如下：

（一）免疫磁性微球孵育细胞：

取培养的MCF-7细胞或待测人血液样品1mL，加入25～100μL免疫磁性微球，室温静置孵育1h；

（二）过滤：

（1）PDMS片的合成及制作：

①取50g：5g双组分有机硅弹性体于一次性水杯中混匀搅拌；

②置于真空装置中进行抽真空，待气泡上升接近纸杯顶端时关掉真空泵，调节使其处于并保持真空状态静止一段时间直至杯内气泡消失液面变澄清；

③待气泡逐渐消失液面变澄清后，放气，取出混合物，加入到事先准备好的容器中使其定形；

④将加有有机硅弹性体的容器置于烘箱中，80℃固定50min，固定后得PDMS片；

⑤用打孔器对合成的PDMS片打孔，孔径为1.9×2.4（mm×mm）；

（2）聚碳酸酯膜过滤分离白细胞及其它血细胞：

①将聚碳酸酯膜置于两片打孔的PDMS片之间，并使上下两孔之间对齐使之形成真空状态；

②注射器吸取孵育后的溶液，PBS溶液进行清洗孵育所用的容器，一并吸入注射器；

③将上述含有样品的注射器置于夹有聚碳酸酯膜的PDMS片上，使注射器头部与PDMS片上端的小孔对齐，PDMS片下端小孔与抽滤装置连通，打开抽滤装置开关，将注射器中的溶液抽滤到废液瓶，而吸附有循环肿瘤细胞的免疫磁性微球则被截留于滤膜上；

（三）磁分离：

上述抽滤完成后，取下滤膜，置于磁分离架上磁分离以进一步去除白细胞，PBS溶液洗涤，得去除白细胞及其他血细胞偶联免疫磁性微球的循环肿瘤细胞。