[发明专利]用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，及其制备方法与使用方法。

背景技术

循环肿瘤细胞的检测有助于研究肿瘤转移机制、指导肿瘤治疗、评估疗效及预后、监测肿瘤的转移或复发。目前用于循环肿瘤细胞检测的方法很多，主要包括富集分离方法、免疫细胞化学技术、流式细胞技术、逆转录聚合酶链反应及CellSearch检测系统等，其中富集分离方法主要包括密度梯度离心法、膜过滤法、免疫磁珠富集法等。由于外周血中循环肿瘤细胞的数量极其稀少，故捕获效率及纯度一直是限制循环肿瘤细胞研究的重要因素，目前大多数方法无法同时达到高效率及高纯度的捕获与检测。CellSearch系统是目前美国食品和药品管理局(FDA)唯一批准的检测循环肿瘤细胞的方法，虽然能实现快速有效地捕获与检测，但捕获效率有待进一步提高，且价格昂贵。最新研究较多的基于膜或芯片过滤的方法虽然大大提高了捕获效率，但是捕获纯度仍不理想。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，及其制备方法与使用方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，包括磁性微球，磁性微球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的上皮细胞特异性抗体。

所述磁性微球，是表面带有羧基或氨基的具有超顺磁性的磁性微球，可以是聚苯乙烯，Fe₃O₄，SiO₂，脲醛树脂，γ-Fe₂O₃等磁性材料（磁性微球通常有三层结构：金属小颗粒层（有磁性），高分子材料层（聚苯乙烯、尿醛树脂、二氧化硅等），功能基层（羧基或氨基等），目前已普遍商品化，能直接购买得到），直径为1～6μm。磁性微球的作用为：既可起到尺寸放大作用，用于实现高回收率膜分离，还可用于磁分离操作，实现高纯度捕获。

所述偶联是指通过共价偶联、疏水作用或者分子间作用力连接在一起。

所述上皮细胞特异性抗体，包括针对循环肿瘤细胞表面特异性抗原的所有抗体种类，可以是多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体，以及核酸适配体。

所述上皮细胞特异性抗体，根据需要捕获的目标肿瘤细胞而选择，比如：需要捕获MCF-7细胞时，选用抗EpCAM抗体。

所述用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球的制备方法，所用磁性微球为羧基磁性微球时，方法为：

（1）羧基磁性微球的活化：取200μL羧基磁性微球，加入250μL的EDC/NHS溶液（EDC:1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，纯度99%；NHS:N-羟基丁二酰亚胺；二者均为现有技术中已有的常规试剂）（EDC/NHS溶液中，EDC、NHS的浓度均为3.2×10³μg/mL），室温下活化30min，磁分离，PBS缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；

（2）羧基磁性微球与抗EpCAM抗体偶联：向上述活化后的磁性微球中加入上皮细胞特异性抗体（比如50～400μL10μg·mL^-1抗EpCAM抗体），室温反应6h，磁分离，PBS缓冲液洗涤，得免疫磁性微球，加1mLPBS缓冲液于4℃保存，备用。

所用磁性微球为氨基磁性微球时，方法为：取200μL氨基磁性微球，加入上皮细胞特异性抗体（比如50～400μL10μg·mL^-1抗EpCAM抗体），以及250μL的EDC/NHS溶液，室温反应3h，磁分离，PBS缓冲液洗涤，得免疫磁性微球，加1mLPBS缓冲液于4℃保存，备用。

利用上述免疫磁性微球捕获外周血中循环肿瘤细胞的方法（即用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球的使用方法）：

（一）免疫磁性微球孵育细胞：

取培养的MCF-7细胞或待测人血液样品1mL，加入25～100μL免疫磁性微球，室温静置孵育1h；

（二）过滤：

（1）PDMS片的合成及制作（为常规方法）：

①取50g：5g双组分有机硅弹性体于一次性水杯中混匀搅拌；

②置于真空装置中进行抽真空，待气泡上升接近纸杯顶端时关掉真空泵，调节使其处于并保持真空状态静止一段时间直至杯内气泡消失液面变澄清；

③待气泡逐渐消失液面变澄清后，放气，取出混合物，加入到事先准备好的容器中使其定形；

④将加有有机硅弹性体的容器置于烘箱中，80℃固定50min，固定后得PDMS片；