[发明专利]用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质组学技术领域，尤其涉及一种用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法。

背景技术

蛋白质是生物体内关键的结构和功能分子，是生命活动的执行者和生命现象的体现者。蛋白质组是指一种细胞或一种组织内的基因在特定条件下表达的所有蛋白质，对于这些蛋白质的分析和鉴定研究称为蛋白质组学。

目前，蛋白质组学的研究方法主要有两类，分别是双向电泳（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2DE）技术和多维液相色谱（Multi-dimensional liquid chromatography，MDLC）技术。双向电泳-质谱技术是目前广泛应用的经典蛋白质研究途径，先将复杂的蛋白质混合物进行胶上分离，再将凝胶上的蛋白质斑点切下，用胰蛋白酶进行胶内酶切后，用质谱仪测定肽质量指纹图谱，最后对这些肽数据进行数据检索而鉴定蛋白质信息。至今因其能够独立地分离大量蛋白而广泛用于蛋白质组的定量和分离中，并能够比较和测量出细胞中生理状态、疾病状态时的差异蛋白质。然而，以2DE为基础的蛋白组学研究方法仍有其技术上的局限性，主要表现在以下几方面：

（1）在双向凝胶电泳图谱上，并非每个蛋白点所包含的蛋白量都足以用于鉴定蛋白；

（2）实验的操作繁琐，实验结果的重现性较差；

（3）对于强酸性蛋白、强碱性蛋白、疏水性蛋白和低丰度蛋白，2D-PAGE尚不能将其很好地检测出来

（4）2D-PAGE不能在线与质谱连接以达到高效的蛋白分离和鉴定水平。

鉴于双向凝胶电泳的一些不足，高效液相色谱技术作为其补充方法应运而生，特别是各种模式色谱联用组成的多维色谱分离技术。此方法用胰蛋白酶把蛋白质混合物样品全部酶切成多肽，再利用多维分离技术将肽段细分成多个组分，送入电喷雾质谱中实现鉴定蛋白质的目的。这种技术具备高分辨率、高重现性及能够与质谱良好兼容等特点。

MDLC中目前较为广泛应用的方法主要是二步正交：即第一维不固定，第二维采用反相液相色谱（RP-LC）直接耦联质谱（2D-LC-MS）。RP-LC因其高效的分离能力、无盐以及便于后续处理而常作为多维分离体系中的最后一维。第一维预分离常用离子交换色谱（Ion-Exchange Chromatography，IEC）、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）、亲和色谱（Affinity Chromatography，AC）等模式。然而，多肽混合物在实施第一维分离时，采用这些模式，会随着流动相的洗脱而导致部分多肽丢失，影响到低丰度蛋白质的检出。为了解决肽段丢失的问题，需要对第一维的预分离新方法进行探索。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、高效的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，可替代传统的离子交换色谱预分离方法，实现了对肽段混合物的高效预分离，避免了肽段的丢失。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，先将生物样品的总蛋白质混合物全部酶切成较短的肽段混合物，使用肽段等电聚焦缓冲液复溶肽段混合物，再采用上样杯上样方式进行等电聚焦电泳。

上述用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，包括以下步骤：

（1）取细胞总蛋白质样品100微克，使用40mM碳酸氢铵溶解，分别加入40mM二硫苏糖醇和100mM碘乙酰胺进行还原和烷基化处理后，按质量比25:1加入4微克测序级胰蛋白酶（Trypsin），在37℃酶解12小时，将所有蛋白质酶切成16-25个氨基酸长度的多肽，得到多肽混合物；

（2）将步骤（1）所得多肽混合物在真空浓缩仪中抽干后，再加入200微升肽段等电聚焦缓冲液复溶；

（3）将步骤（2）中复溶的多肽混合物用于等电聚焦电泳仪电泳，以干胶条和上样杯组合方式上样；

（4）在等电聚焦电泳仪中进行多肽混合物电泳。

根据权利要求2所述的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，其特征在于：步骤（2）中所述加肽段等电聚焦缓冲液是含有7M尿素的水溶液，并添加0.5%pH3-10两性电解质缓冲液（IPG buffer）。

步骤（3）中所述上样是以13cm pH3-10IPG胶条作为聚焦底座，用上样杯压盖胶条形成独立上样口的杯上样方式，胶条上不覆盖石蜡油。