[发明专利]一种食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的评估方法

权利要求书

1.一种评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其步骤包括：(1)使消毒后叶类蔬菜种子萌芽；(2)选择无污染的萌芽种子接种到植物培养基上培养至2-3cm；(3)接种食源性致病微生物至小苗上，接种方式为根部接种或整株接种；(4)根据评估目的确定PCR检测细菌16SrDNA的时点，评估侵染内化和迁移是针对根部接种培养苗，检测时间为接种后培养2-15天；评估残存是针对整株接种培养苗，检测时间为接种后2-30天；(5)用食源性致病微生物的特异性基因验证16SrDNA的阳性结果。

2.根据权利要求1所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于，所述消毒采用乙醇、次氯酸钠、1000万单位农用链霉素300-500倍液、1％高锰酸钾、10％磷酸三钠、1％硫酸铜、福尔马林100倍液的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于，所述种子萌芽是指用无菌水冲净消毒后种子放入0.5％一0.8％重量琼脂培养皿中，其中含葡萄糖重量0.2％一0.5％；每皿20一30粒，20℃一28℃条件下，待种子发芽。

4.根据权利要求1-3之一所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于，所述食源性致病微生物包括沙门菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌。

5.根据权利要求1-4之一所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于所述蔬菜为生菜、油菜、大白菜、甘蓝、菠菜、芹菜、快菜、茼蒿。

6.根据权利要求1-5之一所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于，所述PCR检测细菌的16SrDN A是指常规PCR检测细菌的16SrD N A的方法，所用引物为27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’，将其作为致病菌阳性指标。

7.根据权利要求1-6之一所述的评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其特征在于，所述致病微生物的特异性基因包括：

沙门氏菌，引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp，引物扩增的基因序列：

ATGCGCAGCGTACCACGCAGGGAAAGACACCGCCGTTTAAGAAATGCTAAAGACTGCGCCTGCCGTTATCACTCTCCAACGCCGCAGATATTTGATCGCCTTGAGTTACTGAACCAACAGCTCAATTATGCCTTGCCGGTTGGTATCATTTCTCAGGCAATAATTACAACTGACAACTACCTCGGCTATTCATTGAGTCACTACTTATTTTCCGGAAAACGTACCGCAGCATTCCGCTCATTAGATGACATTTCTTTGTGGATTGAAAAGGGGTCGCTCAGACAACTGATTGTAGATATGGAGGCGCTACCTGTCTCCTGTATTGAGGCGCTTAACCAGCTACGCGCGCTCAGTTGGCAACAAAGCGATATCCAGATTTACCTGCTGGTATCAGATAAAACCTCCGCTATAACACAGTTTATCCGTATGGCTGGGCGTTTTTTTGTCCTGTCGCGACGACAAAATCTGGCCTCAGTACGCGAAGCCTTGTTATCAGCCTCCAAACCTCGCTTATCGGAAAGCTTTAGCCGTACTGACTGGTTGATGATTGAAACTTTAGCGCAAGGCGCCTCTTTAAAAGAAATAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTATCATCGTGTAGTTTACCGGCTTAAACAACTTATCACCCTCCTTAACCTTCCCCACAGGCAAAGCTTTCTTCGGCTGATCCAGCAGCTAAACGTTACTTTCCACGACATTTTTTAA；

大肠杆菌O157：H7，引物EOflicl：GCGCAGCTAAAGCTGATATG，EOflic2：TTAACCCTGCAGCAGAGACA779bp，引物扩增的基因序列：

ATGGCACAAGTCATTAATACCAACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAAATAATATCAACAAGAACCAGTCTGCGCTGTCGAGTTCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGCTTGCGTATTAACAGCGCGAAGGATGACGCCGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACTTCTAACATTAAAGGCCTGACTCAGGCGGCCCGTAACGCCAACGACGGTATTTCTGTTGCGCAGACCACCGAAGGCGCGCTGTCCGAAATCAACAACAACTTACAGCGTATTCGTGAACTGACGGTTCAGGCCACTACAGGGACTAACTCCGATTCTGACCTGGACTCCATCCAGGACGAAATCAAATCTCGTCTTGATGAAATTGACCGCGTATCCGGCCAGACCCAGTTCAACGGCGTGAACGTGCTGGCGAAAGACGGTTCAATGAAAATTCAGGTTGGTGCGAATGACGGCGAAACCATCACGATCGACCTGAAAAAAATCGATTCTGATACTCTGGGTCTGAATGGCTTTAACGTAAATGGTAAAGGTACTATTACCAACAAAGCTGCAACGGTAAGTGATTTAACTTCTGCTGGCGCGAAGTTAAACACCACGACAGGTCTTTATGATCTGAAAACCGAAAATACCTTGTTAACTACCGATGCTGCATTCGATAAATTAGGGAATGGCGATAAAGTCACAGTTGGCGGCGTAGATTATACTTACAACGCTAAATCTGGTGATTTTACTACCACTAAATCTACTGCTGGTACGGGTGTAGACGCCGCGGCGCAGGCTGCTGATTCAGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTGCCACCCTTCATGCTGATGTGGGTAAATCTGTTAATGGTTCTTACACCACAAAAGATGGTACTGTTTCTTTCGAAACGGATTCAGCAGGTAATATCACCATCGGTGGAAGCCAGGCATACGTAGACGATGCAGGCAACTTGACGACTAACAACGCTGGTAGCGCAGCTAAAGCTGATATGAAAGCGCTGYTCAAAGCAGCGAGCGAAGGTAGTGACGGTGCCTCTCTGACATTCAATGGCACAGAATATACCATCGCAAAAGCAACTCCTGCGACAACCACTCCAGTAGCTCCGTTAATCCCTGGTGGGATTACTTATCAGGCTACAGTGAGTAAAGATGTAGTATTGAGCGAAACCAAAGCGGCTGCCGCGACATCTTCAATTACCTTTAATTCCGGTGTACTGAGCAAAACTATTGGGTTTACCGCGGGTGAATCCAGTGATGCTGCGAAGTCTTATGTGGATGATAAAGGTGGTATCACTAACGTTGCCGACTATACAGTCTCTTACAGCGTTAACAAGGATAACGGCTCTGTGACTGTTGCCGGGTATGCTTCAGCGACTGATACCAATAAAGATTATGCTCCAGCAATTGGTACTGCTGTAAATGTGAACTCCGCGGGTAAAATCACTACTGAGACTACCAGTGCTGGTTCTGCAACGACCAACCCGCTTGCTGCCCTGGACGACGCAATCAGCTCCATCGACAAATTCCGTTCTTCCCTGGGTGCTATCCAGAACCGTCTGGATTCCGCAGTCACCAACCTGAACAACACCACTACCAACCTGTCCGAAGCGCAGTCCCGTATTCAGGACGCCGACTATGCGACCGAAGTGTCCAACATGTCGAAAGCGCAGATCATTCAGCAGGCCGGTAACTCCGTGCTGGCAAAAGCTAACCAGGTACCGCAGCAGGTTCTGTCTCTGCTGCAGGGTTAA；

单核细胞增生李斯特菌，hlyF：CGAGCCTAACATATCCAG，hlyR：

GTAAGCCATTTCGTCATC，272bp，引物扩增的基因序列：

ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTTAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTATAAAGATGGAAATGAATATATCGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGATATCCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACATATCCAGGTGCTCTCGTGAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCCGATGTTCTTCCTGTCAAACGTGATTCATTAACACTTAGCATTGATTTGCCAGGAATGACTAATCAAGACAATAAAATTGTTGTAAAAAATGCTACTAAATCGAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCAAAATTTGGTACGGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCATATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTGACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGTGGCTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGTAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGTGCTACTTTTAACCGGGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCCTATACAACAAACTTCTTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATCAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATCTCTTGGGATGAAATAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCAAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACCTACCGCTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACTACACTTTATCCGAAATATAGTAATAGTGTAGATAATCCAATCGAATAA；

金黄色葡萄球菌，引物nucF：AATCATACGGGTCCTTTC，nucR：CAATGTTCTACCATAGCG297bp，引物扩增的基因序列：

ATGAAGTCAAATAAATCGCTTGCTATGATTGTGGTAGCCATCATTATTGTAGGTGTATTAGCATTTCAATTTATGAATCATACGGGTCCTTTCAAAAAGGGGACGAATCATGAAACTGTAGAAGATTTAAATGGTAAAGATAAAGTACATGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGATACATTTATTGCAAATCAAAATGGTAAAGAAATTAAAGTTAGGCTTATAGGGGTTGATACGCCAGAAACGGTGAAACCGAATACGCCTGTACAACCATTTGGCAAAGAAGCATCAAATTATAGTAAGAAGACATTAACAAATCAAGATGTTTATTTAGAATATGATAAAGAAAAACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGCGTATGTATGGATAAGTAAAGATCGTATGTACAATAAGGAATTAGTGGAAAAGGGACTTGCTAGAGAGAAGTATTTTTCACCAAATGGCAAATATAGAAATGTATTTATAGAAGCACAAAATAAAGCTAAACAACAGAAATTAAATATTTGGAGTAAATAA。