[发明专利]一种食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的评估方法

说明书

技术领域

本发明属于叶类蔬菜生产过程中产品安全领域，具体地说，涉及一种食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的评估方法。 

背景技术

随着人们健康观念的加强，新鲜蔬菜的消费量不断增加。研究表明，多吃蔬菜可以减少罹患慢性非传染性疾病的风险。但在消费量增加的同时，新鲜蔬菜引起的微生物性食源性疾病也快速增长。例如，在美国70年代蔬果引起的微生物食物中毒不足1％，到90年代上升为6％。在中国，新鲜蔬果引起的致病微生物食源性疾病鲜有报道。这可能是由于以下原因：(1)我国的食物中毒的漏报率高；(2)中国人生食蔬菜的品种和比例远远低于欧美人；(3)我国蔬菜生产中所使用的化学品比例较高，一定程度上抑制了病原菌的生长、繁殖；(4)许多较轻的食物中毒现象被忽视了；(5)我们的监控系统还不完善，覆盖率较低。 

食品安全问题越来越为广大民众所关注，中国食品安全评估中心认为我国的食品安全排位前三的风险分别为：(1)致病微生物引起的食源性疾病；(2)农药等化学性污染；(3)人为添加非法添加剂。 

随着生活节奏的加快和生活方式的改变，近年来中国居民生食蔬菜的比例也在逐年上升。致病微生物引起的食源性疾病的潜在风险也同样提高。叶类蔬菜营养价值高，新鲜度好，以其茎叶为主要可食部分，是中国人的主要消费蔬菜品种，但因其表面积大、水分含量高、易于破损、不耐储存而容易携带食源性致病微生物。 

在国外由于蔬菜携带的致病微生物引起食源性疾病不断增加，相应的也进行了广泛的研究，其中蔬菜生产过程中的食源性致病微生物侵染是一个重要方 面。但迄今为止，并没有一个简单易行的规范方法来评估食源性致病微生物侵染蔬菜的能力，以及蔬菜抵御食源性致病微生物侵染的能力。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种评估食源性致病微生物侵染叶类蔬菜的方法，其步骤包括：(1)使消毒后叶类蔬菜种子萌芽；(2)选择无污染的萌芽种子接种到植物培养基上培养至2-3cm；(3)接种食源性致病微生物至小苗上，接种方式为根部接种或整株接种；(4)根据评估目的确定PCR检测细菌16SrDNA的时点，评估侵染内化和迁移是针对根部接种培养苗，检测时间为接种后培养2-15天；评估残存是针对整株接种培养苗，检测时间为接种后2-30天；(5)用食源性致病微生物的特异性基因验证16SrDNA的阳性结果。 

所述消毒是指蔬菜种子清水洗涤干净、浸泡后，选适当消毒剂消毒一定时间，所述消毒剂为乙醇、次氯酸钠、1000万单位农用链霉素300-500倍液、1％高锰酸钾、10％磷酸三钠、1％硫酸铜、福尔马林100倍液等的一种或几种。所述种子萌芽是指用无菌水冲净消毒后种子放入0.5％-0.8％琼脂培养皿中(含葡萄糖0.2％-0.5％)；每皿20-30粒，一定温度下发芽(20℃一28℃)，待种子发芽。所述无污染指萌芽种子中没有细菌和真菌污染的发芽种子。将萌芽种子放入组培瓶中，每瓶3-6粒；光照培养一定时间后，可根据需求以不同方式接入不同种类、不同浓度的食源性致病微生物；接入食源性致病微生物后，再培养一定时间，随后检测蔬菜不同部位的食源性致病微生物的存在情况，以评估某种蔬菜与某种食源性致病微生物的相关性。 

所述食源性致病微生物包括沙门菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病细菌。所述食源性致病微生物菌种的制备方法是指将菌株分别在营养琼脂培养基上活化后，挑取单菌落，接种营养肉汤培养 基，37℃培养16小时，制成接种用菌悬液备用，其浓度为10³／mL至10⁸／mL。 

所述蔬菜为生菜、油菜、大白菜、甘蓝、菠菜、芹菜、快菜、茼蒿等可以种子发芽的叶类蔬菜。 

所述PCR检测细菌的16SrDN A是指常规PCR检测细菌的16SrDN A的方法，所用引物为27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’，将其作为致病菌阳性指标，为防止检测过程杂菌污染，可以用不同致病菌的特异基因序列作为验证指标。 

所述致病微生物的特异性基因包括： 

沙门氏菌选择(引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp)引物扩增的基因序列： 

Salmonella enterica subsp. 

Gene=″fimY″ 

NCBI Reference Sequence：NC_003197.1