[发明专利]小鼠成肌细胞的制备方法及其应用无效
申请号: | 201410157261.4 | 申请日: | 2014-04-16 |
公开(公告)号: | CN103881966A | 公开(公告)日: | 2014-06-25 |
发明(设计)人: | 刘文斌;张晓东;杜润蕾;陈艳 | 申请(专利权)人: | 武汉大学 |
主分类号: | C12N5/073 | 分类号: | C12N5/073 |
代理公司: | 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222 | 代理人: | 张火春 |
地址: | 430072 湖*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 小鼠 细胞 制备 方法 及其 应用 | ||
发明领域:
本发明涉及成肌细胞的获得方法,更具体地说,本发明涉及小鼠成肌细胞的制备方法,以及该方法的应用。
现有技术的描述:
成肌细胞是一种胚胎祖细胞,它能够分化成为肌肉细胞。当成肌细胞融合在一起时就会形成骨骼肌纤维,因此肌纤维具有多个细胞核,每一个核起源于单个的成肌细胞。成肌细胞融合是骨骼肌特异的(例如二头肌),而心肌和平滑肌则不是这样。那些没有分化成肌纤维的成肌细胞则去分化为卫星细胞。这些卫星细胞紧贴在肌纤维上,存在于肌纤维膜和肌内膜间。这些连接组织将肌束分成单个的肌纤维(Kuang S,Cell Stem Cell,2008,2(1):22-31;Sacco A,Nature,2008,456(7221):502-506)。骨骼成肌细胞长期为研究者提供了一个很好的体外研究肌细胞增殖和分化的工具(Nguyen TH,BMC Cell Biol,2010,11:57)。成肌细胞分化的研究对理解肌肉细胞发育和修复(再生)是非常重要的。培养中的成肌细胞可以表现出肌肉发生过程的特征,包括增殖,迁移,融合,肌管形成和收缩。生长于含有10%胎牛血清培养基中的肌肉细胞即使汇合了,也继续增殖;而当它们生长于含2-5%马血清的培养基中时,却发生融合并形成肌管。小鼠细胞系C2C12和C2F3是广泛用来研究成肌细胞增殖和分化的细胞系。目前的科研要求研究者从实验动物中分离和培养原代的成肌细胞。Thomas A.Rando通过几轮的“粘附-脱离”的处理,分离和富集了成肌细胞,丢弃了肌成纤维细胞(Rando TA,J Cell Biol,1994,125(6):1275-1287)。Moira A.Lawson同样也使用差异粘附的步骤,分离和富集鸡的成肌细胞(Lawson MA,Cell Tissues Organs,2000,167(2-3):130-137)。Yu Zhang报道肌成纤维细胞可以保护成肌细胞,以免发生内在的伴随有分化的凋亡(Zhang Y,Dev Growth Differ,2010,52(8):725-733)。
在研究中发现,采用Rando描述的方法来分离和分化新生小鼠的成肌细胞非常困难,成功率低。随着实验步骤的增加,得到的成肌细胞越来越少,过程中丢失了很多成肌细胞和卫星细胞,卫星细胞是成肌细胞分化所必需的,并且是成肌细胞的来源;少数存活下来的成肌细胞生长及其缓慢,非常容易发生凋亡。
发明技术内容:
本发明的第一个目的是提供一种小鼠成肌细胞的制备方法,采用该方法,可方便快捷地获得大量的小鼠成肌细胞,成活率高,生长旺盛,可以很好地用于分化成肌管的研究,其细胞学特征和分子表达的变化稳定。
本发明的第二个目的是提供所获取的成肌细胞在研究肌管形成及肌肉发育细胞、分子机理方面的应用。
本发明公开了一种小鼠成肌细胞的制备方法,该方法包括下列步骤:
A)将刚离体、并剪碎的小鼠腿部肌肉按体积比1:2加入分散剂,在37℃颠倒摇动5-10min,1000rpm离心5min,去上清,得组织碎片;
B)组织碎片中按体积比1:2加入分散剂,在37℃上下颠倒摇动5-10min成浆糊状,按体积比1:10加入血清以终止酶消化;
C)过滤80μm无菌尼龙网,去除大的组织碎片,滤液1000rpm离心5min,去上清,得沉淀;
D)沉淀置胶原蛋白包被的培养皿中,加原代成肌细胞生长培养基,在37℃,5%CO2的培养箱中培养;
E)当成肌细胞生长到40-80%丰度时,去生长培养基,加分化培养基,每天更换分化培养基持续培养成肌细胞,直至肌管被诱导形成;
其中,分散剂组成是0.2%胶原酶和0.05%分散酶,余量为PBS,pH=7.5-7.8;原代成肌细胞生长培养基由80%F10,19%FBS,1%青霉素和链霉素,2.5-5.0ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF组成;分化培养基由94-97%DMEM,2-5%马血清,1%青霉素与链霉素组成。
本发明还公开了一种优选的制备方法,该方法包括下列步骤:
A)将刚离体、并剪碎的小鼠腿肌肉按体积比1:2加入分散剂,在37℃颠倒摇动10min,1000rpm离心5min,去上清,得组织碎片;
B)组织碎片中按体积比1:2加入分散剂,在37℃上下颠倒摇动10min成浆糊状,按体积比1:10加入血清以终止酶消化;
C)过滤80μm无菌尼龙网,去除大的组织碎片滤液1000rpm离心5min,去上清;
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