[发明专利]一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程，具体地说，涉及一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法。

背景技术

动物转基因技术起始于20世纪80年代初期，是指将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并稳定遗传给后代的一种技术手段。动物转基因技术具有广阔的应用前景,如制备动物生物反应器、提高畜禽生产能力及肉奶品质、培育抗病动物、生产人类用动物器官、建立人类疾病模型等,将给人类带来巨大的经济效益。特别是猪，由于其生理特征与人类相似、及其生命周期长等特点，目前被认为是理想的动物模型。因此，转基因猪就显得尤为重要，除了对基础研究有重要意义外，对应用也有很大作用。随着我国政府对农业问题的持续关注和大力支持，我国农业发展取得了长足的进步，特别是与动物相关的畜牧类产业的飞速发展，使人民的生活状况及饮食结构获得了极大的改善。但是同时也提出严峻挑战，在我国，主要畜牧类品种则严重依赖于进口，在主要的畜牧类品种中，奶牛品种依赖程度达100%，猪、鸡品种依赖程度接近90%，这意味着作为动物农业整个产业链源头的畜牧类品种，严重依赖于国际市场。传统的遗传育种方法对猪进行抗病性、肉品质等性状的改良难以在短期内实现根本性突破，但是由于转基因效率不高，因此常常需要选择标记基因来进行后期筛选和检测。同时选择标记基因的存在又影响邻近基因和目的基因的表达，同时还存在重要的生物安全问题，大大限制其未来的研究和应用2009年，本课题组利用体外转录mRNA瞬时表达Cre酶，获得标记基因敲除的转基因牛，但是这种方法存在效率低，步骤繁琐，随机挑选克隆进行鉴定，工作量大。目前为止，还没有一种技术可以简单、快速、高效的对猪进行marker free的相关研究，由于其重要性，因此标记基因敲除的转基因猪的研究显得尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术中存在得问题，本发明的目的是提供一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法，所述方法包括以下步骤：

1）构建自我剪切元件TmOCN；

2）构建带有自我剪切元件的打靶载体；

3）筛选阳性克隆细胞；

4）体细胞克隆获得F0代标记基因去除的阳性猪；

进一步地，所述自我剪切元件TmOCN主要包括以下核心元件：TmO代表精简的小鼠早期胚胎发育转录因子OCT4的特异启动子，这个启动子在猪早期胚胎发育过程中特异表达；C代表Cre重组酶基因，可以介导同向loxp位点之间任何序列的切割；N代表转基因动物常用的neo筛选标记基因。所述自我剪切元件的最大特点，是在SCNT过程中的猪早期胚胎发育阶段特异启动Cre酶进行自我剪切，达到在F0代自动敲除标记基因的目的。

进一步地，所述步骤2）将步骤1）构建的自我剪切元件TmOCN替换于普通的打靶载体的正筛选基因当中，得到带有自我剪切元件的打靶载体。

所述自我剪切元件具有通用性和灵活性，可以用于猪和其它大动物的任何打靶载体及其转基因载体当中，只要通过简单的分子操作即可将常规的打靶载体或转基因载体改成筛选基因自我剪切的载体，而且最快速的在F0代获得筛选基因去除个体。

进一步地，所述步骤3）将步骤2）得到的带有自我剪切元件的打靶载体，转染猪胎儿成纤维细胞，进行正负筛选获得打靶成功的阳性克隆细胞。

作为优选，所述打靶载体为MSTN-TmOCN marker free打靶载体。本发明将以本实验室的MSTN（肌肉生成素抑制基因）的打靶载体作为实施例，用以说明本发明所述方法。

进一步地，所述步骤4）将步骤3）筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆，获得F0代的标记基因去除阳性猪。其是利用自我剪切元件特点——由于Cre酶由TmOCT4启动子启动，其是在猪早期胚胎发育时特异启动，因此F0代即可获得敲除筛选标记neo基因的猪。

本发明还提供了由前述步骤3）筛选获得的阳性克隆细胞，以及所述阳性克隆细胞在生产基因敲除克隆猪中的应用。

本发明还提供了前述转基因猪筛选标记基因敲除的方法在生产基因敲除克隆猪中的应用。