[发明专利]一种胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体及其应用

权利要求书

1.一株杂交瘤细胞，其保藏编号为CGMCC No.8705。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞制备的抗体。

3.一种检测样品中胰蛋白酶抑制因子含量的试剂盒，该试剂盒含有由权利要求1所述的杂交瘤细胞制备的胰蛋白酶抑制因子的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由权利要求1所述的杂交瘤细胞制备的胰蛋白酶抑制因子的单克隆抗体、胰蛋白酶抑制因子、包被缓冲液、封闭液、20×浓缩洗液、30×浓缩样品提取液、抗体稀释液、1×样品稀释液、酶标板、盖板膜、酶标试剂、底物液A、底物液B和终止液组成。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述胰蛋白酶抑制因子的单克隆抗体制备过程如下：用权利要求1所述的杂交瘤细胞通过小鼠体内诱生腹水法得到腹水；将腹水进行二氧化硅吸附，得到澄清的腹水；将澄清的腹水依次进行辛酸－硫酸铵沉淀法和亲和层析纯化得到。

6.根据权利要求3-5任一所述的试剂盒，其特征在于：所述小鼠为6～8周龄雌性健康BALB/c小鼠。

7.一种检测样品中胰蛋白酶抑制因子含量的方法，包括如下步骤：

（1）用包被缓冲液配制胰蛋白酶抑制因子溶液，得包被液；

所述包被缓冲液为0.02M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；

（2）用（1）制备的包被液包被酶标板，弃去孔内液体，得到包被的酶标板；

（3）向包被的酶标板中加入封闭液，得到封闭的酶标板；

所述封闭液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为BSA、小牛血清、吐温20和蔗糖；所述BSA在所述封闭液中的浓度为1g/100ml，所述小牛血清在所述封闭液中的体积百分含量为10%，所述吐温20在所述封闭液中的体积百分含量为0.05%，所述蔗糖在所述封闭液中的浓度为10g/100ml；

（4）用1×洗涤液工作液洗涤封闭的酶标板，拍干；

所述1×洗涤工作液由双蒸水或去离子水将20×浓缩洗液稀释20倍得到；

所述20×浓缩洗液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和吐温20；所述氯化钠在所述20×浓缩洗液中的浓度为160.0g/L，所述氯化钾在所述20×浓缩洗液中的浓度为4.0g/L，所述十二水合磷酸氢二钠在所述20×浓缩洗液中的浓度为72.6g/L，所述磷酸二氢钾在所述20×浓缩洗液中的浓度为4.8g/L，所述吐温20在所述20×浓缩洗液中的浓度为10mL/L；

（5）将样品溶液和不同浓度的标准品溶液加入步骤（4）制备的酶标板中，再加入抗体工作液，振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应；

所述抗体工作液为用抗体稀释液配制的胰蛋白酶抑制因子的单克隆抗体溶液；

所述标准品为胰蛋白酶抑制因子；

所述标准品中含有标准品1，标准品1为标准品浓度为0的空白溶液；

所述样品溶液是用1×样品稀释液配制而成；

所述标准品溶液用抗体稀释液配制而成；

所述1×样品稀释液由溶剂和溶质组成，溶剂为PBS缓冲液，溶质为巯基乙醇和明胶，所述巯基乙醇在所述1×样品稀释液中的浓度为0.2M，所述明胶在所述1×样品稀释液中的浓度为0.01M；所述PBS缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄；所述NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度为8g/L，所述KCl在所述PBS缓冲液中的浓度为0.2g/L，所述KH₂PO₄在所述PBS缓冲液中的浓度为0.2g/L，所述Na₂HPO₄在所述PBS缓冲液中的浓度为0.46g/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.4；

所述抗体稀释液由溶剂和溶质组成，溶剂为0.02M、pH7.4的磷酸盐缓冲液，溶质为吐温20和明胶；所述吐温-20在所述抗体稀释液中的浓度为0.1ml/L，所述明胶在所述抗体稀释液中的浓度为1g/L；

（6）重复步骤（4）一次；

（7）在步骤（6）的酶标板中加入酶标试剂，振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光反应；

所述酶标试剂为用抗体稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG；

（8）将等体积底物液A与底物液B混合，得显色液；

所述底物液A由溶剂和溶质组成，溶剂为蒸馏水，溶质为过氧化氢脲、十二水合磷酸氢二钠、一水柠檬酸、吐温20；所述过氧化氢脲在所述底物液A中的浓度为0.1g/100ml,所述十二水合磷酸氢二钠在所述底物液A中的浓度为3.58g/100ml,所述一水柠檬酸在所述底物液A中的浓度为1.03g/100ml,所述吐温20在所述底物液A中的体积百分含量为0.01%；

所述底物液B由溶剂和溶质组成，溶剂为蒸馏水，溶质为四甲基联苯胺二盐酸、一水合柠檬酸、硫代硫酸钠；所述四甲基联苯胺二盐酸在所述底物液B中的浓度为0.04g/100ml,所述一水合柠檬酸在所述底物液B中的浓度为0.2g/100ml,所述硫代硫酸钠在所述底物液B中的浓度为0.01g/100ml；

（9）将显色液加入步骤（7）的酶标板中，用盖板膜盖板后，置37℃避光反应；

（10）加入终止液，振荡混匀，于450nm处读取样品孔和标准品孔的数值；

所述终止液为浓度为2M的H₂SO₄水溶液；

（11）按照如下公式计算样品和标准品的百分吸光率：

B—除标准品1之外的标准品或样品的450nm平均吸光度值；

B0—标准品1的450nm平均吸光度值；

（12）以除标准品1之外的标准品的浓度（单位ng/ml）的lg值为横坐标，对应的百分吸光率为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线公式；

（13）将样品的百分吸光率带入标准曲线公式，得到样品中胰蛋白酶抑制因子的浓度。