[发明专利]用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用

权利要求书

1.一种剔除转基因猪筛选标记基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)构建CPP5-Cre原核表达载体；

2)利用步骤1)表达载体进行CPP5-Cre融合蛋白的表达及纯化；

3)将步骤2)得到的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞进行孵育共培养获得克隆；

4)鉴定筛选标记基因剔除的阳性克隆；

5)通过体细胞克隆获得F0代，筛选标记基因剔除的转基因猪个体；

所述CPP5-Cre融合蛋白包括细胞穿膜肽CPP5和位点特异重组酶Cre蛋白，所述细胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)将含有CPP5序列及其NcoI和NdeI两个酶切位点的引物对，通过体外做成linker；用NcoI+NdeI酶双切pET-28.2CRE，回收得到目的片段与linker连接，转化、摇菌、小提质粒、酶切鉴定阳性的pCPP5-CRE载体；所述pCPP5-CRE载体的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)将步骤4)筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆获得F0代筛选标记基因剔除的转基因阳性猪。

4.CPP5-Cre融合蛋白在生产筛选标记基因剔除的转基因猪中的应用，其特征在于，将CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞共培养，鉴定筛选标记基因剔除的阳性克隆，通过体细胞克隆获得F0代，筛选标记基因剔除的转基因猪个体；

所述CPP5-Cre融合蛋白包括细胞穿膜肽CPP5和位点特异重组酶Cre蛋白，所述细胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。