[发明专利]用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程，具体地说，涉及一种用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用。

背景技术

动物转基因技术是在经典遗传学、分子遗传学和DNA重组技术的基础上，运用基因工程等技术手段，将感兴趣的外源目的基因或重组基因稳定整合于宿主动物的染色体基因组并稳定遗传给后代的一种新兴生物技术。最早于1976年由Jaenisch首先利用逆转录病毒感染小鼠早期胚胎首次得到莫氏白血病病毒转基因小鼠。随着新技术新方法的出现，动物转基因技术也在不断的完善之中。利用传统的转基因方法，如显微注射法、精子载体法、电穿孔法、体细胞克隆法等，已经制备了转基因小鼠、大鼠、猪、牛、羊、鸡等多种转基因动物。而且由于猪于人类具有大量相似的解剖、生理、代谢、病理。例如，他们有一个非常相似的胃肠道解剖和功能、胰腺形态和代谢调节。因此猪比小鼠更适合用于人类疾病模型研究，同时猪肉又是人类主要的营养来源。伴随着ZNF/TALEN/Cas9等最新技术的出现，使得转基因大动物具有更加广阔的应用前景，如制备动物生物反应器、提高畜禽生产能力及肉奶品质、培育抗病动物、生产人类用动物器官、建立人类疾病模型等,将给人类带来巨大的经济效益。在我国，主要畜牧类品种则严重依赖于进口，在主要的畜牧类品种中，奶牛品种依赖程度达100%，猪、鸡品种依赖程度接近90%，这意味着作为动物农业整个产业链源头的畜牧类品种，严重依赖于国际市场。因此转基因技术提高迫切需要。目前最大限制转基因技术发展的障碍是筛选标记基因的存在。因为在转基因过程中，除了表达目的基因外，还需要筛选标记基因。标记基因即选择性标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。由于转基因效率低，因此必须利用标记基因对阳性克隆进行筛选和富集。但标记基因的存在不仅对邻近基因及其目的基因表达产生影响，同时还将带来严重的安全性问题。目前虽然有一些技术可以去除筛选标记基因，但是这些方法主要用于小鼠，而且有很大缺陷。例如通过瞬时表达Cre重组酶载体，需要额外的细胞转染过程，而且存在整合隐患和细胞毒性。在大动物的研究很少，2009年，本课题组利用体外转录mRNA瞬时表达Cre酶，获得标记基因敲除的转基因牛。目前为止，还没有对猪进行筛选标记基因即（marker free）的相关研究。因此建立简便、高效、快速标记基因敲除的转基因猪技术研究显得尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于剔除标记基因的融合蛋白及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于剔除标记基因的CPP5-Cre融合蛋白，所述融合蛋白包括细胞穿膜肽CPP5和位点特异重组酶Cre蛋白，所述细胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种表达前述CPP5-Cre融合蛋白的载体。

本发明还提供了一种剔除转基因猪筛选标记基因的方法，所述方法包括以下步骤：

1）构建CPP5-Cre原核表达载体；

2）利用步骤1）表达载体进行CPP5-Cre融合蛋白的表达及纯化；

3）将步骤2）得到的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪体细胞共培养；

4）鉴定筛选标记基因剔除的阳性克隆；

5）通过体细胞克隆获得F0代，筛选标记基因剔除的转基因猪个体。

进一步地，所述步骤1）将含有CPP5序列及其NcoI和NdeI两个酶切位点的引物对，通过体外做成linker；用NcoI+NdeI酶双切pET28.2-Cre，回收得到目的片段与linker连接，转化、摇菌、小提质粒、酶切鉴定阳性的pCPP5-CRE载体；所述pCPP5-CRE载体的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

进一步地，所述步骤3）将步骤2）得到的CPP5-Cre融合蛋白与带有筛选标记基因的猪成纤维细胞，进行孵育共培养获得克隆。

进一步地，所述步骤5）将步骤4）筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆获得F0代筛选标记基因剔除的转基因阳性猪。

本发明进一步提供了前述CPP5-Cre融合蛋白和表达该融合蛋白的载体在生产筛选标记基因剔除的转基因猪中的应用。