[发明专利]以痕量DNA为基础的二代测序文库构建方法

权利要求书

1.本发明涉及一种针对痕量DNA样品，构建二代测序文库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 

步骤（1）、细胞分离及细胞总DNA提取； 

步骤（2）、构建Inserting DNA1与Inserting DNA2插入序列双链； 

步骤（3）、以步骤（2）所获得的插入序列双链组装插入复合体； 

步骤（4）、以插入复合体打断待测DNA，PCR扩增测序片段； 

步骤（5）、回收扩增的PCR片段，并进行测序建库工作。 

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的Inserting DNA1的结构包含测序系统插入结构单元，测序primer1；Inserting DNA2的结构包含测序系统插入单元，测序primer2，DNA分子随机标签，样品Barcode，及用于和测序primer3配对的序列。 

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的细胞样本来源于个体化的病理组织，正常生理组织，血液样本，皮肤及毛发，优选来源为临床肿瘤样本，每个样本包含10,000-20,000个细胞。 

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的总DNA提取步骤为：对细胞样本进行裂解，吸附柱吸附DNA，漂洗，洗脱等，所获得的DNA溶于20ul水中。 

5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，上述步骤（5）的操作步骤为，使用琼脂糖凝胶电泳步骤（4）PCR扩增获得的DNA片段，将大小在目标区域的DNA片段切下，并回收其中的DNA，获得的DNA片段即可用于二代测序或进行目标区域捕获后测序。 

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的DNA分子随机标签为6～20个随机碱基，用于标定每一个原始的DNA分子。 

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于， 

步骤（2）所述的Inserting DNA1的结构依次包含原EZ-Tn5^TM转座酶测序系统adapter1，测序primer1，EZ-Tn5转座子序列；Inserting DNA2的结构依次包含原EZ-Tn5^TM转座酶测序系统adapter2，测序primer2，DNA分子随机标签，样品Barcode，及用于和测序primer3配对的序列，EZ-Tn5转座子序列； 

步骤（3）所述的插入复合体的构建方法为，将步骤（2）所述的Inserting DNA1和Inserting DNA2、以及甘油、EZ-Tn5^TM转座酶在PCR管内混匀，置于PCR仪器上，温育。 

步骤（4）所述的插入复合体打断待测DNA的方法为，在PCR管中加入步骤（3）构建的插入复合体、基因组DNA、打断缓冲液混匀并置于PCR仪上，温育。 

8.权利要求1-7任一所述的建库方法在制备针对特异性疾病的诊断试剂盒中的应用。 

9.权利要求1-7任一所述的建库方法在制备以痕量DNA样本为基础的二代测序试剂盒中的应用。 

10.由权利要求8所述的方法制备获得的诊断试剂盒。