[发明专利]以痕量DNA为基础的二代测序文库构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用EZ-Tn5^TM转座酶构建微量DNＡ二代测序文库的方法，利用转座子插入打断DNA的同时将测序平台的adapter及测序引物加至DNA片段之上，并使用随机碱基对每一个原始分子进行标定。

背景技术

DNA测序已经成为生物学研究中不可缺少的一项重要技术，从根本上改变了人们研究生命蓝图的方式。随着测序平台硬件及相应软件的优化，阻碍研究进展的亦非测序技术本身而是与其相关的文库构建以及数据的分析和解释。

454Life Sciences公司(Roche)首先推出了革命性的基于焦酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。该技术的原理是酶级联化学发光反应:首先将PCR扩增的单链DNA与引物杂交，并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。焦盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光。CCD检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。此后，Illumina公司和ABI公司相继推出了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)测序技术。它们与焦磷酸测序法的原理类似，核心思想都是边合成边测序(sequencing by synthesis)，即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。大规模即第二代测序技术平台主要包括利用焦磷酸测序的Roche/454FLX、边合成边测序的Illumina sequencing systems(HiSeq2500/1500,HiSeq2000/1000,Genome Analyzer IIx,MiSeq)和连接酶测序法的life technologies Sequencing systems(Applied Biosystems SOLID及Ion Torren)。

所有相关的技术平台都涉及复杂的文库制备过程，即将基因组或反转所得的DNA连接上各自平台特异的adapter。标准的文库构建过程包括基因组DNA经机械或酶切进行片段化，末端修复，接头序列连接，电泳切胶选择合适片段以及PCR扩增等步骤，只是不同的测序平台在测序上机之前会有相应的一些小的修饰。尽管标准文库构建方法适用于大多数需要测序的研究，但其对DNA起始量需求较多，通常需要1-10ug，因此当起始DNA量不足以用于标准文库构建的时候，相关的研究就会受到限制。例如，在肿瘤基因组相关研究中，虽然二代测序技术为我们对肿瘤的理解提供了许多新的认识，并筛选出许多与乳腺癌、直肠癌、白血病、肺癌、胰腺癌、脑瘤、肝癌、肾癌等相关的基因和重要信号通路；但同时也认识到肿瘤的发生具有很强的异质性，即使在同一个人不同肿瘤甚至同一个肿瘤的不同部位存在很高的异质性。

为了研究特定疾病所涉及的细胞群体异质性，就需要对疾病样本组织内部进行多点以及尽可能小的取样，因此就需要能够针对少量细胞构建没有偏差的二代测序文库。

发明内容

本发明人以广泛使用的典型二代测序系统，EZ-Tn5^TM转座酶测序平台为基础，研发了一种适用于前述多种二代测序平台，大幅度降低测序建库所需DNA量的技术，能够使用痕量DNA构建二代测序文库的方法。