[发明专利]一种肝素含量的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，涉及一种肝素含量的检测方法。

背景技术

肝素(heparin)是一种糖胺聚糖，是被广泛应用的抗凝血药物。肝素是由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡糖胺及葡糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，分子量从5至30KDa，其中硫酸根约占40%。肝素的抗凝血功能主要是通过它与抗凝血酶的结合来实现的。抗凝血酶III（AT-III）的精氨酸酶活性部位可以与含丝氨酸的凝血酶和凝血因子XIIa、XIa、Xa、IXa的丝氨酸酶活性部位结合，形成无凝血活性的抗凝血酶III-凝血因子复合物，而达到抗凝血作用。肝素带有大量负电荷，能与抗凝血酶III上带正电荷的赖氨酸结合，肝素中独特的戊聚糖序列，就是肝素与抗凝血酶III的结合位点。肝素与抗凝血酶III结合，使抗凝血酶III发生分子构象变化，暴露精氨酸活性部位，增加与凝血因子中丝氨酸接触的概率，使反应速率增加约1000倍，从而增强抗凝血酶III的抗凝血活性。

肝素作为临床医学中一种最常用的抗凝治疗剂，使用肝素时要精确把握肝素用量，以避免出现用量过少达不到抗凝效果，用量过多又会引起自发性出血的状况，保持机体出凝血功能有效平衡。但是，由于肝素是一种高度带负电荷的异质性混合物，容易与血液中带正电荷的蛋白非特异性结合，导致难以计算与抗凝血酶III特异性结合的肝素含量。因此，在临床应用中，必须通过实验检测肝素抗凝的实际效果从而得出肝素的最佳剂量。

常见的应用于临床的肝素有普通未分级肝素(Unfractionated heparin, UFH)，低分子量肝素(low-molecular-weight heparin, LMWH)和磺达肝素(fondaparinux)。普通未分级肝素的平均分子量是 15000。低分子量肝素的平均分子量是 4000 到6500。而磺达肝素是化学合成的戊聚糖化合物，它的分子量为 1728，基本上由与抗凝血酶结合的戊聚糖序列组成。普通未分级肝素既可抑制抗凝血酶也可抑制活化因子X，低分子量肝素则主要抑制活化因子X。磺达肝素只能抑制活化因子X，而不能抑制抗凝血酶。

普通未分级肝素价格相对低廉，是最早应用到临床的肝素。它是一种带大量负电荷的异质性的混合物。在血液里，它和带正电荷的蛋白非特异性结合，因此有多少肝素和抗凝血酶特异性结合很难计算。这样，普通未分级肝素的用量难以预测，用量过少达不到抗凝效果，用量过多又会导致出血。所以在临床应用中，必须通过实验室的严格监测来测量肝素抗凝的实际效果来找到并维持最佳剂量。

低分子量肝素比普通未分级肝素的糖链要短很多。这样就减少了许多与血液中蛋白的非特异结合。因此，它在血液中的半衰期比普通未分级肝素要长，抗凝血效果也更容易预测，由于和血小板作用引起的副作用也降低。磺达肝素虽然价格相对昂贵，但它基本上由与抗凝血酶结合的戊聚糖序列组成，所以它的特异性更强，在血液中的半衰期也更长。

然而，低分子量肝素和磺达肝素在临床应用中，由于病人的体质，性别，年龄，体重，用药等的不同，也会出现药量不足或过量的情况。因此，为了避免引起出血和对病人实施个体化治疗，实验室的监测必不可少。

现有技术中关于测定肝素含量的方法有多种。其中，临床中常用活化部分凝血活酶时间 (activated partial thromboplastin time, APTT) 常用来间接反映肝素治疗是否恰当，其基本操作是在血浆中加入钙离子，脑磷脂和其他激活物质如白陶土，这些物质激活内源性凝血级联系统，促进血浆凝固，而活化部分凝血活酶时间(APTT)就是血浆凝固所需的时间。肝素的用量可以根据APTT时间的长短来进行调整，从而找到最佳剂量范围。APTT是一种凝固法。作为检测肝素的方法之一，它操作简单、快速、便宜。然而，通过活化部分凝血活酶时间（APTT）推测肝素最佳剂量范围的方法，在临床实践中经常被质疑，尤其是对低分子量肝素和磺达肝素的应用。主要是因为利用这种方法得出的肝素最佳剂量也常常出现血栓和出血现象，而且应用此法时，患者需要多次检测、调整肝素剂量。因此，活化部分凝血活酶时间（APTT）并不是一个能被用来准确推测的肝素最佳剂量范围的指标。并且，活化部分凝血活酶时间(APTT)只能用于普通肝素检测，不能用于低分子肝素和磺达肝素检测。