[发明专利]重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及聚乙二醇化重组人促红素的生产技术领域，尤其涉及一种重组人促红素聚乙二醇化反应液的光谱检测法及其应用。 

背景技术

促红细胞生成刺激剂(Erythropoiesis-stimulating Agents，ESAs)是对肾性贫血疾病十分有效的治疗药物。ESAs能够从根本上纠正贫血症状，明显地恢复患者的体能，提高患者的生活质量。此外，消除贫血症状可以显著地减少其它相关疾病的发病率和死亡率。不过，由于ESAs的体内半衰期相对较短，因此患者通常需要每周一至三次给药。为了克服这个缺点，近年来，研究人员对重组人促红素(recombinant human Erythropoietin，EPO)的蛋白质结构进行了化学修饰研究，以改善其药代动力学和药效学，从而允许给药频率的减少。与此同时，能够与蛋白质分子发生共价键合的水溶性聚乙二醇化合物(Polyethylene Glycol，PEG)，已经被成功地应用于改善一些蛋白质药物的药代动力学和降低其免疫原性。经过PEG化修饰的EPO药物(PEG-EPO)，被称为新一代长效EPO，也已经被成功制备(其化学反应式如图1所示)，并在欧洲等地区成为处方药物。相关的动物研究数据和临床研究结果表明，PEG-EPO具有延长的体内半衰期，与常规EPO相比，能够允许较低的给药频率，可以是两个星期给药一次，甚至是四个星期给药一次。这种不太频繁的给药方式，给予了患者和医疗服务提供者一个很大的便利。特 别地，PEG-EPO药物可以在整个治疗周期内，维持患者血红蛋白水平的稳定性，减少了治疗副作用的产生。 

选择合适的PEG试剂和PEG化反应条件，PEG化虽不会对生物分子的活性位点或者生物功能产生明显的影响，但它通常至少会有一定的影响，尤其是当形成多取代PEG化产物时，很有可能对蛋白质的活性位点产生位阻效应，降低其体外活性乃至体内活性。而降低PEG化反应的多取代率，同时提高其单取代率，并从所得反应液中纯化得到单取代产物，则一直都是PEG化蛋白质药物研究过程中的重点和难点。中国专利《聚合物/重组人促红素偶联物》(200710123683.X)，公开了一种PEG-EPO药物的制备方法，其最终产物中不含多取代PEG-EPO产物(multi-PEG-EPO)。在该专利的实施例中，对所得最终产物进行了动物实验，所得数据证实了其具有长效性。相关的专利《一种单取代PEG-EPO的纯化及制备方法》(201010516922.X)，公开了一种单取代PEG-EPO产物(mono-PEG-EPO)的纯化工艺。在该纯化工艺中，需要采用疏水层析方法，分离multi-PEG-EPO和mono-PEG-EPO。因此，所得PEG-EPO反应液中multi-PEG-EPO的含量，以及mono-PEG-EPO与multi-PEG-EPO之间的比例，对纯化工艺的整体难度和成本有很大的影响。在保持mono-PEG-EPO产量的较高水平的同时，减少multi-PEG-EPO的产量，可以显著地节省纯化工艺的处理时间和物料成本。另一个专利《回收促红细胞生成素的方法》(201210313863.5)，公开了一种从PEG-EPO反应液中回收未反应的EPO蛋白质的方法。在该专利的实施例中，对回收得到的EPO进行了PEG化反应测试，所得单取代率为35.5％，多取代率为4.4％，说明了回收的EPO仍然具有较强的PEG化反应活性。在此反应结果中，虽然mono-PEG-EPO的 产量较低，但是mono-PEG-EPO与multi-PEG-EPO之间的比例很高，对后续的纯化工艺具有明显的好处。进一步研究结果表明，采用专利《重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法》(201210257542.8)所公开的EPO的PEG化方法，可以有效地将所得回收EPO的单取代率提高到40％以上，总反应率大于60％。这说明了，EPO的PEG化反应液中的游离EPO仍然具有一定的PEG化反应活性。