[发明专利]蓖麻蚕蛹做生物反应器制备重组人表皮生长因子的方法

权利要求书

1.蓖麻蚕蛹做生物反应器制备重组人表皮生长因子的方法,其特征在于：通过基因工程技术将入门载体pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF整合到目的载体线性化AnpeNPV DNA核多角体基因启动子下游，获得表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA，所述表达载体经处理后接种蓖麻蚕蛹，高效表达HCEGF，经孵育、分离纯化制备出功效类似天然产物的的重组人表皮生长因子；其中：

（1）所述入门载体的构建方法为：

用NcoⅠ/EcoRⅠ双酶切消化HCEGF/pET-28a质粒，获得拥有从起始密码子ATG到终止密码子TAA结束的完整阅读框架（orf）、且N端附有6xHis的6xHis-HCEGF基因片段，将该基因片段插入到Nco Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切过的pENTR^TM4Dual质粒的NcoⅠ和EcoR Ⅰ之间，获得入门载体pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF，使6xHis-HCEGF片段位于质粒中的attL1和attL2之间；

（2）所述目的载体的构建方法为：

提取柞蚕杆状病毒AnpeNPV DNA，通过DNA同源同组技术在AnpeNPV DNA的核多角体基因启动子下游插入由AvrⅡ酶切位点相连的attR1和aatR2序列构建目的载体AnpeNPV，抽提AnpeNPV DNA并通过AvrⅡ酶切线性化；

（3）所述表达载体的构建方法为：

取所述入门载体pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF150ng、目的载体线性化AnpeNPVDNA150ng、5×LR克隆酶混合物2μl、pH8.0TB缓冲液混合至10μl，25℃温浴1-16小时；pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGFDNA与线性化AnpeNPV DNA在LR克隆酶作用下进行重组，生成表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPVDNA；

（4）所述表达载体接种蓖麻蚕蛹前的处理方法为：用所述表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA接种柞蚕宿主AnPe细胞，27℃培养1周后收取上清表达载体病毒液并反复扩大培养后进行斑点形成法测定感染力PFU和-80℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的蓖麻蚕蛹做生物反应器制备重组人表皮生长因子的方法,其特征在于：所述孵育的温度是27℃，孵育时间为1周。

3.根据权利要求2所述的蓖麻蚕蛹做生物反应器制备重组人表皮生长因子的方法,其特征在于：所述分离纯化首先是对孵育后的蚕蛹进行研磨，然后收集上清液，再进行硫酸铵沉淀和Ni-NTA Agrose亲和层析分离纯化，最终得到功效类似天然产物的的重组人表皮生长因子。