[发明专利]蓖麻蚕蛹做生物反应器制备重组人表皮生长因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及蓖麻蚕蛹做生物反应器、重组杆状病毒做基因表达载体制备重组人表皮生长因子的方法。

背景技术

人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)是由53个氨基酸组成的多肽，分子量约为6000Da，其生物学功能使其在制药和化妆品领域具有广泛的应用。人表皮生长因子具有促进上皮再生的功能，可以用于促进外科手术伤口及其它创面的愈合，如皮肤移植、皮肤的擦伤、烧伤、糜烂等；还具有促进角膜上皮细胞的增殖的作用，用来治疗角膜损伤、溃疡以及促进移植角膜的存活；还能抑制胃酸分泌，可用于消化性溃疡的治疗；还能加快表皮更新，使表皮细胞个体年龄年轻化，起到护肤、抗皱、美白等美容效果，可用于化妆品领域。因而，获得类似天然重组人表皮生长因子具有重要的经济价值。

人表皮生长因子曾在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和家蚕杆状病毒中成功地表达，但利用蓖麻蚕蛹做生物反应器、重组杆状病毒做基因表达载体制备重组人表皮生长因子的方法未见有报道。蓖麻蚕蛹做生物反应器、重组杆状病毒做基因表达载体的方法属真核细胞基因表达方法，具有蛋白质翻译后修饰过程，表达效率高，表达产物的生物学特性与天然产物相似等优势。

广西是唯一的蓖麻蚕保种基地，拥有成熟的蓖麻蚕饲养技术和丰富的木薯叶饲料资源。利用蓖麻蚕茧壳加工蚕丝绵、蚕蛹做生物反应器的新用途，对提升蓖麻蚕的经济价值，促进广西的养蚕事业发展具有重要意义。所用蚕蛹具有廉价，可储存，运输方便，无须饲养或细胞培养，可机械化操作等优点。

发明内容

本发明的发明目的在于：提供一种以蓖麻蚕蛹做生物反应器、重组杆状病毒做基因表达载体制备重组人表皮生长因子的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：通过基因工程技术将入门载体pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF整合到目的载体线性化AnpeNPV DNA核多角体基因启动子下游，获得表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA，所述表达载体经处理后接种蓖麻蚕蛹，高效表达HCEGF，经孵育、分离纯化制备出功效类似天然产物的的重组人表皮生长因子；其中：

（1）所述入门载体的构建方法为：

用Nco Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切消化HCEGF/pET-28a质粒，获得拥有从起始密码子ATG到终止密码子TAA结束的完整阅读框架（orf）、且N端附有6xHis的6xHis-HCEGF基因片段，将该基因片段插入到Nco Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切过的pENTR^TM4Dual质粒的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ之间，获得入门载体pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF，使6xHis-HCEGF片段位于质粒中的attL1和attL2之间；

（2）所述目的载体的构建方法为：

提取柞蚕杆状病毒AnpeNPV DNA，通过DNA同源同组技术在AnpeNPV DNA的核多角体基因启动子下游插入由AvrⅡ酶切位点相连的attR1和aatR2序列构建目的载体AnpeNPV，抽提AnpeNPV DNA并通过AvrⅡ酶切线性化；

（3）所述表达载体的构建方法为：

取所述入门载体pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF150ng、目的载体线性化AnpeNPVDNA150ng、5×LR克隆酶混合物2μl、pH8.0TB缓冲液混合至10μl，25℃温浴1-16小时；pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGFDNA与线性化AnpeNPV DNA在LR克隆酶作用下进行重组，生成表达载体重组柞蚕杆状病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA。

（2）所述表达载体接种蓖麻蚕蛹前的处理方法为：

用所述重组柞蚕杆状病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA接种柞蚕宿主AnPe细胞，27℃培养1周后收取上清表达载体病毒液并反复扩大培养后进行斑点形成法测定感染力PFU和-80℃保存备用。

进一步地，所述孵育的温度是27℃，孵育时间为1周。

进一步地，所述分离纯化首先是对孵育后的蚕蛹进行研磨，然后收集上清液，再进行硫酸铵沉淀和Ni-NTA Agrose亲和层析分离纯化，最终得到功效类似天然产物的的重组人表皮生长因子。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：