[发明专利]一种食源性致病菌DNA的阶段控温快速提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及食源性致病菌DNA的快速提取方法。

背景技术

食品安全问题一直是各国政府和人民群众最为关心的问题，由食源性致病菌引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。在HACCP体系的建立和实施过程中，致病性病原微生物一直是各类食品加工行业控制的重点。

食源性致病菌是引起细菌性食物中毒的病原菌。食源性致病菌多达几十种，主要有金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，志贺氏菌和副溶血性弧菌、大肠杆菌、单核增生李斯特菌、肉毒杆菌等。食源性致病菌对人体健康的影响主要是指微生物本身及其代谢过程、代谢产物对食品原料、加工过程和产品的污染，这种污染会对食品消费者的健康造成损害。

传统的食源性致病菌的分离培养检测方法检测周期长，需要4-7d，且操作步骤繁琐、特异性差。因此建立快速、灵敏、准确的检测技术来检测食源性致病菌显得尤为重要，聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学检测技术因其特异性和灵敏度高而被广泛采用。而PCR检测技术的第一步就是模板DNA的制备，即样品中DNA的提取，直接影响着PCR反应的结果。长期以来，样品中DNA的提取和纯化一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度。因此，建立一种快速的DNA提取 方法对提高PCR检测效率起着至关重要的作用。

本技术领域所熟知的DNA提取方法主要有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、试剂盒方法等。CTAB方法提取的DNA纯度，为1.8左右，应用较广泛，但其操作步骤繁琐，长达8步，且实验过程中用到苯酚氯仿等有毒试剂，而试剂盒方法因其提取的DNA纯度高达1.8-2.0，是目前应用最为广泛的一种方法，但其操作耗时长达1-2h。

发明内容

本发明的目的在于解决现有DNA提取耗时长、步骤多的难题，提供了一种快速提取食源性致病菌DNA的方法，且提取的DNA质量满足后续检测方法要求，从而加快了食源性致病菌的检测速度，以便更好地为食源性疾病的预防和控制提供帮助。

本发明的技术方案是按以下步骤进行：

(a)取食品样品10-25g(mL)或致病菌菌株至适宜液体培养基制备培养液，然后取1-5mL细菌培养液，8000-12000rmp离心1-4min，使细菌细胞沉淀，弃上清；

(b)往步骤(a)制得的的菌体沉淀中加入100-500uL无菌双蒸水，充分混合，8000-12000rmp离心1-4min，弃上清；

(c)往步骤(b)制得的细菌沉淀中加入100-500uL细胞裂解液，悬浮细菌沉淀，并于105℃-126℃油浴10s-3min；

(d)将步骤(c)所得的混合液移至70℃-95℃水浴5-30min；

(e)步骤(d)结束后，8000-12000rmp离心1-4min取上清，上清液即为模板DNA，对提取所得DNA进行质量检测，剩余DNA于-20℃保 存备用。

现有技术中的DNA提取方法耗时长达数小时，本发明方法综合运用了水浴及油浴进行阶段控温，通过裂解液裂解细胞，从而快速的获取DNA，整个提取过程不到40min，简单有效。本方法不需要特别的实验仪器及试剂，成本相对较低。使用本方法提取的DNA样品浓度在50-400ng/uL，所得的DNA纯度即OD260/OD280的比值为1.6-1.8.且所得的DNA质量可以满足普通PCR、荧光PCR、环介导等温扩增等检测方法的要求。

表1金黄色葡萄球菌DNA浓度及纯度

表2乙型副伤寒沙门氏菌DNA的浓度和纯度

表3牛奶中单核增生李斯特菌DNA的浓度及纯度

附图说明

图1：金黄色葡萄球菌DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图1中，M为15000bp Maker；1，2，3为105℃油浴10s，70℃水浴5min。

图2：金黄色葡萄球菌DNA的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。

图2中，M为2000bp Maker，1-3分别对应图1中1-3。

图3：乙型副伤寒沙门氏菌DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图3中，M为15000Maker；1，2，3为110℃油浴60s，70℃水浴30min。

图4：乙型副伤寒沙门氏菌DNA的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。

图4中，M为15000Maker；1-3分别对应图3中1-3。