[发明专利]硫柳汞在荧光定量PCR中的应用

说明书

本发明针对生物化学领域，公开了一种荧光定量PCR反应液，所述反应液包含有作为增强剂或协同增强剂的硫柳汞。本发明涉及硫柳汞的一种新用途，对于PCR反应而言，其除了能作为防腐剂提高反应液的稳定性之外，还能单独或与其他PCR增强剂一起协同提高PCR反应的扩增效率、灵敏度，以及增加荧光值。另外，本发明的反应液配方避免了常规PCR体系配方中因添加其他剧毒防腐剂，如叠氮钠等带来的环境污染的弊端，为开发硫柳汞在新的领域中的应用奠定了基础。

技术领域

本发明针对生物化学领域，涉及硫柳汞在荧光定量PCR中的应用，特别是用于核酸检测荧光定量PCR。

背景技术

定量PCR是在定性PCR基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术（Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR）于1996年由美国Applied Biosystems推出，它是在PCR反应体系中加入荧光探针，通过荧光信号的不断积累来实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线来计算出待测样品的起始拷贝数。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，并且与普通PCR相比，它具有范围宽（0-1×10⁸）、灵敏度高（可检测<5个拷贝）、特异性强、精确度高（CV<2%）、无需后续处理、避免了交叉污染及可以进行多重检测的优点而被广泛应用于科研及临床诊断等领域。

PCR增强剂在PCR反应中起到提高反应的特异性、增加PCR扩增灵敏度及防止无效扩增等有益效果而被广泛应用于PCR体系中。迄今为止，在提高PCR扩增能力、增强反应体系稳定性的研究中，人们已经发现了越来越多的PCR增强剂和稳定剂，它们都以各自的特性在不同的方面对PCR反应起着促进作用。如甲酰胺是被较早发现并广泛应用的PCR添加剂之一，据报道，它能显著提高PCR反应的特异性。Rapley等人于1994年研究发现T4噬菌体基因32编码蛋白及大肠杆菌单链结合蛋白对数种模板的PCR反应均有提高效率的作用。Rees WA等人通过研究发现在长片段PCR中添加甜菜碱能降低热变性温度和退火温度，进而能促进高GC含量片段的扩增，而且还能提高PCR产物的产量。Eric Chevet等人发现在体系中添加氯化四甲基铵（TMAC）可以提高AT含量丰富的DNA片段的Tm值，从而通过改善引物的特异性结合来提高PCR反应的特异性。牛血清白蛋白（BSA）则能够通过防止聚合酶的变性提高扩增反应效率。DMSO是用于增强反应特异性的常见添加剂，加入DMSO有利于减少DNA的二级结构，使高GC含量的模板的易于完全变性。

随着对PCR增强剂的研究深入，人们逐渐从研究和应用单一型PCR增强剂转向研究和应用复合型PCR增强剂。Musso等应用1.3M甜菜碱，50uM7-deaza-dGTP及5％DMSO混合而成的复合型增强剂高产量扩增了GC含量为79％的长度为392bp的DNA片段，接下来在另外两段DNA片段（GC含量为67.8％和72.7％）的扩增中这种复合型PCR添加剂同样能帮助获得高特异性的扩增产物。随着荧光定量PCR应用的进一步扩大，传统PCR增强剂已经不能满足日新月异的PCR体系，近年来，科研人员已经将目光转向新材料、新化合物。比如纳米材料等。但是，多年来人们对这些添加剂的研究表明，它们在一定的浓度范围内对某些PCR有着增效作用，但在另外一些情况下或在其它的浓度范围内对PCR反应又有着抑制作用，所以PCR添加剂在不同反应体系中的应用应通过试验来合理选择，因此，优化的PCR反应体系配方或添加剂组合会使PCR反应获得很大的改善。