[发明专利]一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法

权利要求书

1.一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法，其特征在于:

基于质谱的代谢组学技术研究有机污染物对细胞的毒性效应，其操作步骤如下：

a）采用液液萃取法分别对细胞外及细胞内的代谢物进行提取，分别得到胞外及胞内代谢产物提取液；

b)建立了细胞代谢产物的UPLC-QTOF全景式分析方法，包括极性及非极性化合物同时高通量分析，同时利用UPLC-QTOF的检测结果，寻找污染物处理组与未加污染物的对照组比较相对含量变化较大（采用SPSS19.0软件在p=0.05置信水平对检测化合物的含量对进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan’s法对均值进行多重比较，p<0.05、p<0.01分别认为差异显著和极显著）的化合物，对此类化合物（包括氨基酸，脂肪酸，甘油，尿素及糖）建立HPLC-MS/MS的定性及定量分析方法；

c）采用代谢流量分析系统（陈琦,王卓,魏冬，代谢网络流分析进展及应用，2010，55，14：1302-1309）对b)中HPLC-MS/MS检测的胞外代谢物利用外标定量法进行计算分析，污染物处理组与未加污染物的对照组相比较，计算出污染物处理组对细胞显著性影响的代谢路径，并对影响的程度做分析；采用路径分析系统利用对b)中HPLC-MS/MS检测的胞内代谢物进行追踪分析，污染物处理组与未加污染物的对照组相比较，同样计算出污染物处理组对细胞显著性影响的代谢路径，并对影响的程度做分析；代谢流量分析系统和路径分析系统共同计算出的与对照组显著差异的代谢路径（且差异程度一致）既可限定为污染物影响的代谢路径，用此方法可以用于分析高关注新型有机污染物对细胞的毒性效应。

2.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：

此方法涉及到的有机污染物主要包括一些对甲状腺、肝脏、肾脏、肺等器官具有潜在的致癌性，已列入或将被列入POPs候选名单的污染物中的一种或二种以上，如短链氯化石蜡、六溴环十二烷、得克隆和苯并[a]芘二醇环氧化物等中的一种或二种以上。

3.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：

步骤a中供试细胞为人肝癌细胞HepG2，暴露浓度参考环境中污染物的实际浓度（不同的污染物的浓度范围不同，例如短链氯化石蜡1-100μg/L），暴露时间为24小时，萃取液胞外代谢物的为甲醇/水（体积比80:20）,萃取液胞内代谢物的为MTBE、甲醇和水（体积比20：6：7）；

步骤b中通过优化色谱分析条件和质谱参数实现了UPLC-QTOF全景式分析2000多种（包括极性的及非极性的化合物，如氨基酸，脂肪酸，脂类等）胞外代谢产物，同时利用HPLC-MS/MS对氨基酸脂肪酸等50种（氨基酸、脂肪酸、甘油、尿素等）靶向代谢物的定量分析；

步骤c中代谢流量分析及代谢通路（路径）分析主要包括了糖代谢，能量代谢、蛋白质合成，氨代谢，氨基酸代谢等步骤中的一种或二种以上。

4.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤a中液液萃取后溶液需要高速离心3-5min，以达到沉淀蛋白的目的。

5.按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤b中UPLC-QTOF的流动相为乙腈和水（1%乙腈保留1min,线性增加到40%乙腈从1min到5min,继续到50%乙腈从5min到8min,继续到65%乙腈从8min到10min,到76%乙腈从10min到16min,最后到100%乙腈从16min到20min保持5min）流动相体积比为40:60），相对于甲醇，乙腈能检测到更多的代谢产物，步骤b中HPLC-MS/MS的流动相为：甲醇和水（梯度洗脱程序为：0-2min时甲醇用量为5%；3min后甲醇用量提高到40%，保持5min；在1min内甲醇用量降到5%，然后再保持9min），相对于乙腈，甲醇更有利于同分异构体的分离；

UPLC-QTOF质谱参数为：正离子模式，毛细管电压4000V,裂解电压为175V,喷雾气氮气为45psi,干燥气氮气为9L/min，温度为350℃。中心离子数据数据设置为m/z80-1100，安捷伦的MassHunter工作站进行后续分析；

步骤b中HPLC-MS/MS的喷雾电压为3000V；辅助气为5psi；鞘气为30psi；毛细管温度和蒸发气的温度均为300℃，此参数设置很适于检测化合物的高灵敏度及稳定性。