[发明专利]一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法

说明书

技术领域

本发明是一种环境污染物毒性效应评价的新方法，是基于质谱的代谢组学技术研究高关注新型有机污染物对细胞的毒性效应,具体地说是一种利用质谱分析技术和代谢组学软件相结合评估环境污染物对细胞毒性效应的方法，该方法具有前处理简单，分析时间短，重复性好，获得信息量全面等优点。

背景技术

持久性有机污染物(persistant organic pollutant，POPs)具有毒性高，生物累积性强，远距离迁移的特性，成为典型的全球性污染物。环境介质中普遍存在短链氯化石蜡(short chain chlorinated paraffins,SCCPs)、六溴环十二烷(Hexabromocyclododecanes,HBCDs)、得克隆（Dechlorane Plus,DPs）、(tetrabromobisphenol A,TBBPA)和苯并[a]芘二醇环氧化物(Benzo[a]pyrene diolepoxides,BPDEs)等有机污染物，它们对甲状腺、肝脏、肾脏、肺等器官具有潜在的致癌性，已列入或将被列入POPs候选名单。各种环境介质（土壤、沉积物、大气、水体、生物体）中均已检出该类污染物。因此，针对这些污染物建立快速有效的毒性评价方法并开展相关的污染调查工作迫在眉睫。针对不断涌现的新型有机污染物，寻找一种简单、快速有效的毒性评价技术成了摆在众人面前的难题。目前许多新型有机污染物以及环境中存在的持久性有机污染物可用于人体健康风险评价的基础数据还很少，在毒理学研究中对人体健康影响的相关研究十分薄弱,不足以支持得出有实际意义的结论（杨永滨，生态毒理学报。2006,105-115）,利用代谢组学对细胞毒性评估是污染物毒性研究的新手段（刘鹏，大连医科大学学报。2008,565-569）但是传统的细胞代谢毒性评估方法存在分析周期长，测试方法繁琐，需要多种仪器相结合，且获得的信息量有限等缺点，因此急需发展一种高效快速且信息量丰富的分析手段来评估细胞的代谢毒性，质谱技术的高速发展成了近年来代谢组学研究的主要工具，UPLC-QTOF具有高灵敏度，可全景式分析代谢产物的特点，HPLC-MS/MS存在定量精确，测试范围广的优点（Monique P,Christine V.S,Konstantinos P,et al.Rapid Commun Mass Spectrom,2003,17:1297-1311），代谢流量分析系统可以利用细胞外代谢产物的变化量计算相应的胞内代谢物的变化情况（Jens N,Fozia N,Elmar H.Toxicol Appl Pharm,2009,240:327-336），代谢路径分析可以利用胞内的代谢产物对代谢路径进行深入的分析，因此有机的结合质谱技术、统计分析平台及代谢组学软件在一起，对于快速高效的研究环境污染物对细胞的毒性效应具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于发展一种操作简单、周期短、获得信息量丰富的细胞毒性效应评价的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:

利用UPLC-QTOF对全景代谢物进行分析，分析的结果指导HPLC-MS/MS进行胞内及胞外代谢物的靶向分析，利用该流程分析了人肝癌细胞HepG2在污染物暴露下的胞内及胞外代谢物含量，利用统计学分析、代谢路径及代谢流量分析对细胞的毒性评估:

a）供试细胞为人肝癌细胞HepG2，暴露浓度参考环境中污染物的实际浓度，暴露时间为24小时，胞内代谢物的分析采用MTBE/甲醇/水三相系统，使得样品极性代谢物提取、非极性代谢物提取与除蛋白步骤一步完成；

b)建立了细胞2000多种代谢产物(细胞全组分非靶标分析)的UPLC-QTOF的分析方法，同时建立了50种代谢产物（氨基酸、脂肪酸、甘油、尿素、乳酸等）的HPLC-MS/MS定量定性方法；

c）代谢流量分析系统通过胞外的检测结果可以计算胞内的代谢流量，代谢路径分析可以直观的分析胞内的代谢变化，二者的相互佐证可以系统评价环境污染物对细胞的毒性效应。

此方法涉及到的高关注新型有机污染物包括已列入或将被列入POPs候选名单的污染物，如短链氯化石蜡、六溴环十二烷、得克隆和苯并[a]芘二醇环氧化物等；

步骤a中萃取液胞外代谢物的为甲醇/水比例为80:20,胞内代谢物的为MTBE/甲醇/水比列为20:6:7。