[发明专利]可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用有效
| 申请号： | 201410161721.0 | 申请日： | 2014-04-22 |
| 公开（公告）号： | CN103966188A | 公开（公告）日： | 2014-08-06 |
| 发明（设计）人： | 吴珍芳;张献伟;李紫聪;刘德武;贺晓燕 | 申请（专利权）人： | 华南农业大学 |
| 主分类号： | C12N9/24 | 分类号： | C12N9/24;C12N15/56;C12N15/10;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 龚燮英 |
| 地址： | 510642 广东省广州市天*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 动物 细胞 表达 分泌 重组 聚糖 及其 方法 应用 | ||
1.一种可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶，其特征在于，所述重组葡聚糖酶的核苷酸序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:3。
2.根据权利要求1所述的可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶，其特征在于，所述重组葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID No:2或SEQ ID No:4。
3.权利要求1或2所述的可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶的重组方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对微生物来源的葡聚糖酶基因Bg17A和eg1314的成熟肽区密码子进行优化，人工去除基因Bg17A和eg1314自身信号肽序列，将SEQ ID No:5所示的猪腮腺蛋白信号肽序列添加到密码子优化后的Bg17A和eg1314基因成熟肽N端进行基因改造，改造后的基因分别为：SEQ ID No:6所示的pBgA和SEQ ID No:7所示的pEGX；
(2)、将改造后的基因5’端和3’端分别添加EcoRI和XhoI限制性内切位点后，克隆到pUC57质粒中，再利用EcoRI和XhoI内切酶分别酶切，得到含有改造基因的内切酶片段，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1(+)质粒中，分别获得载体pCDNA-pBgA和pCD-pEGX；
(3)、去除pEGX基因N端PSP信号肽序列，和pBgA基因C端的终子密码子，借助序列号为SEQ ID No:10的刚性肽A3连接，将pEGX基因连接到pBgA基因C端，并在pEGX基因C末端添加flag-tag标签，得到重组β-葡聚糖酶pBgA3pEG，其核苷酸序列为SEQ ID No:1，氨基酸序列为SEQ ID No:2；
(4)、将步骤(3)获得的重组葡聚糖酶pBgA3pEG克隆到pCDNA3.1(+)载体中，获得pCD-pBgA3pEG；以pCD-pBgA3pEG为模板，SEQ ID No:11和SEQ ID No:12为引物进行第一次扩增得到pBgA-2A；然后以步骤(2)中的载体pCD-pEGX为模板，SEQ ID No:13和SEQ ID No:14为引物进行第二次扩增得到2A-pEGX；
(5)、以SEQ ID No:11和SEQ ID No:14作为引物，以步骤(4)获得的pBgA-2A和2A-pEGX为模板，进行基因重叠延伸PCR扩增，获得重组β-葡聚糖酶pBg2ApEG，其核苷酸序列为SEQ ID No:3，氨基酸序列为SEQ ID No:4。
4.根据权利要求3所述的可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶的重组方法，其特征在于，步骤(4)和(5)中所述PCR扩增条件为：98℃10s；60℃5s；72℃10～20s;35个循环；72℃2min。
5.权利要求1或2所述的可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶在制备细胞生物反应器或转基因动物中的应用。
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