[发明专利]可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用

说明书

技术领域

本发明技术属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种可在动物细胞表达分泌的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用。

背景技术

β-葡聚糖属于植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，是由β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合体，分子量大约在6500KDa以上，广泛存在于高等植物细胞壁中，在大麦、燕麦胚乳细胞壁中含量高，大麦中β-葡聚糖含量约4％-10％。在小麦、黑麦，玉米，高粱，小米中等禾谷类农作物也有一定含量，β-葡聚糖分按其溶解性分为水溶性和非水溶性两类，其可溶部分可以在动物胃肠道内形成粘性食糜，影响动物内源消化酶扩散，进而影响营养物质消化，不溶解部分是植物细胞壁的主要成分，部分营养物质包埋其中，阻碍消化酶的消化。β-葡聚糖是大麦、燕麦小麦、黑麦，玉米，高粱，小米中主要的抗营养成分。

β-葡聚糖酶(β-glucanase)可以水解大麦、小麦和黑麦等谷物中的β-葡聚糖，催化裂解β-葡聚糖分子中β-1，3-1，4糖苷键，降解生成小分子寡糖和葡萄糖。不少研究显示，猪，禽小麦，大麦基础日粮中添加β-葡聚糖酶可以提高动物对粗蛋白，能量，AA利用效率，改善动物生产性能，减少畜禽排泄物中的氮、臭气排放(X.Ao,2010a； Owusu-Asiedu et al.,2012；Willamil et al.,2012)。葡聚糖酶已经成为动物饲料添加剂最常用外源酶制剂，是一类高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂。但是这些外源消化酶动物自身不能分泌，一直以来都是先利用微生物发酵获得相应的酶，在人工添加饲料中，添加到饲料中的添加剂容易受饲料制粒、膨化、贮存等因素影响，且需要不断添加，效果不理想，成本高。

目前，一大批β-葡聚糖酶(β-glucanase)基因已经在各种细菌，真菌成功克隆出来，如Alicyclobacillus sp.A4CelA4基因(Bai et al.,2010)，Paecilomyces sp.FLH30来源PsBg16A(Hua et al.,2011)基因，(Hua et al.,2011),Bisporasp.MEY-1Bg17基因(Luo et al.,2010),B.licheniformis EGW039eg1314基因(Teng et al.,2006)等。这些基因克隆后，经大肠杆菌或者酵母发酵产酶，根据报道绝大多数酶基因最适pH较窄，在不同pH缓冲液中仅有一个峰，很难适应动物胃肠道pH1.0～7.0持续变化的酸碱环境，在动物胃肠道中仅能在胃或者肠道发挥水解作用，作用时间短，其耐酸碱，耐胃蛋白酶，胰蛋白酶能力参差不齐，其最适作用温度严重偏离动物正常体温，多分布在40-70℃。饲料制粒温度多数要求80-95℃，其实际应用中，对酶耐热能力要求较高，受诸多因素影响，很难选择理想的酶用于生产。

因此，有必要对β-葡聚糖酶进行改良，以期能适应动物胃肠道环境。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶及其重组方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种可在动物细胞分泌表达的重组葡聚糖酶，所述重组葡聚糖酶的核苷酸序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:3；所述重组葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID No:2或SEQ ID No:4。

本发明还提供了上述重组葡聚糖酶的重组方法，包括以下步骤：

(1)对微生物来源的葡聚糖酶基因Bg17A和eg1314的成熟肽区密码子进行优化，人工去除基因Bg17A和eg1314自身信号肽序列，将SEQ ID No:5所示的猪腮腺蛋白信号肽序列添加到密码子优化后的Bg17A和eg1314基因成熟肽N端进行基因改造，改造后的基因分别为：SEQ ID No:6所示的pBgA和SEQ ID No:7所示的pEGX；

(2)、将改造后的基因5‘端和3’端分别添加EcoRI和XhoI限制性内切位点后，克隆到pUC57质粒中，再利用EcoRI和XhoI内切酶分别酶切，得到含有改造基因的内切酶片段，将其克隆到哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1(+)质粒中，分别获得载体pCDNA-pBgA和pCD-pEGX；