[发明专利]一种含有水蛭或地龙成分的中药制剂的生物活性测定方法

权利要求书

1.一种含有水蛭或地龙成分的中药制剂的生物活性检测方法，其特征在于，通过检测凝血酶的活性反映该制剂的抗凝生物活性。

2.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，通过荧光共振能量转移(FRET)方法检测凝血酶活性大小以间接反映含有水蛭或地龙成分的中药制剂的抗凝血酶作用。

3.根据权利要求1所述的生物活性测定方法，其特征在于，采用荧光标记的凝血酶的肽类底物，通过监测其荧光密度的变化反映凝血酶的活性。

4.根据权利要求2所述的生物活性测定方法，其特征在于，所述的检测凝血酶活性的荧光共振能量转移(FRET)方法具体操作步骤如下：

采用美国AnaSpec公司的520试剂盒

(1)制备工作液

1×测试缓冲液：将5ml的2×测试缓冲液(试剂C)加入5ml去离子水中；

凝血酶稀释液：使用1×测试缓冲液对凝血酶(试剂D)进行25倍稀释，96孔板，每孔加入稀释后的凝血酶溶液5μl，根据需要调整进行稀释的酶量；

凝血酶底物溶液：使用1×测试缓冲液对凝血酶底物(试剂A)进行100倍稀释，每次试验都需要制备新鲜的底物溶液，因为试剂A中的凝血酶底物对光敏感，请避光操作；

0.9％生理盐水溶液：溶解0.9g NaCl到100ml去离子水中；

(2)制备反应溶液

依次在96孔荧光测定板中加入37℃预热的1×测试缓冲液、0.9％生理盐水、含有水蛭或地龙药材成分的中药提取液、凝血酶，混匀即得反应溶液；

(3)测定荧光密度

将上述加好溶液的96孔荧光板37℃预热15min，加入凝血酶底物溶液50μl，Ex/Em=485nm/535nm立即测定荧光密度(RFU)，测定持续30min，每间隔5min记录数据。

5.根据权利要求3所述的生物活性测定方法，其特征在于，肽类底物核心氨基酸序列为Phe-Pro-Arg。

6.根据权利要求4所述的生物活性测定方法，其特征在于，96孔板中每孔含有纯化的凝血酶20～200ng，或5mU～5U。

7.根据权利要求4所述的生物活性测定方法，96孔板中每100μl反应溶液中加入含有水蛭或地龙药材成分的中药制剂提取液体积为10～90μl。